胃癌患者胃液中特异性荧光物质初步确定

胃癌患者胃液中特异性荧光物质初步确定

1整理ppt研究背景1990年,我中心开始致力于通过检测血清和胃液的荧光光谱来诊断胃癌的系列研究。先后利用288nm紫外光作为激发光,对500例各种胃内疾患患者的胃液进行高效液相荧光光谱检测,发现胃癌患者胃液中存在两种特异性荧光物质,其含量较胃内良性病变明显增多。2整理ppt研究背景在上述实验的根底上,我们试图通过联合使用高效液相及质谱技术分析高效液相荧光光谱中保存时间为11.5～12.5min的荧光物质成分,从而对良恶性胃病患者胃液高效液相荧光光谱差异的物质进行初步分析。3整理ppt研究目的从胃癌患者胃液中发现特异性荧光物质,并以此来获得肿瘤标志物。4整理ppt研究方法收集10例胃癌患者与10例非胃癌患者的胃液,浓缩后行高效液相分析,并收集高效液相荧光光谱中保存时间为11.5～12.5min的荧光物质;再经质谱鉴定,所得结果与L-色氨酸的质谱比较,最终确定这种荧光物质的主要组分。5整理ppt研究结果在高效液相的荧光光谱保存时间为11.5～12.5min时,胃癌患者胃液中有特异性荧光物质,其含量较其他胃内良性病变患者明显增多。6整理ppt胃良、恶性病变患者浓缩胃液的高效液相荧光光谱7整理ppt研究结果空白对照的一级质谱图中有共同质荷比为279及288的峰;10例胃癌患者的一级质谱图中,均出现质荷比为205,217,279,288,404,790及811的峰,有些还出现409。而10例胃内良性病变患者的一级质谱图中,均出现质荷比为279,404,790及811的峰。8整理ppt胃良、恶性病变患者胃液荧光峰收集样品的一级质谱图2172059整理ppt研究结果推测胃癌患者胃液中含量较多的特殊荧光物质可能对应的是质荷比为205及217的峰。经质谱鉴定后显示,胃癌患者胃液中质荷比为205的物质与L-色氨酸的三级质谱完全一致,证实该物质为L-色氨酸〔L-tryptophan〕。10整理ppt讨论近年来经大量研究证实,机体内存在许多内源性荧光物质,它们形成的综合荧光光谱,在良性病变及肿瘤患者之间确实存在差异。而体液是肿瘤发生、演进及转移的内环境,肿瘤生长过程中分泌及代谢产物会直接影响体液的组成。对体液进行荧光检测,有可能发现良恶性之间的差异。11整理ppt讨论在本实验条件下,对应着高效液相保存时间为3.5～4.5min及11.5～12.5min的两种物质,利用高效液相技术,可以将胃液中保存时间在11.5～12.5min的特异性荧光成分别离出来,减少其他物质的干扰,并可进一步行质谱分析。12整理ppt讨论比照实验中,从胃癌及胃内良性病变患者的质谱图发现,两者均为混合物。证实在液相保存时间为11.5～12.5min的收集物中,同时存在荧光及无荧光的物质。而胃癌患者独有质荷比为205及217的峰。据此推测,胃癌患者特异性荧光物质的相对分子质量可能为204或216。13整理ppt讨论L-色氨酸是一种重要的可产生荧光的芳香氨基酸。其相对分子质量为204.2,本实验证实,它与胃癌特异性荧光物质之一的保存时间一致。与质荷比为205物质的一、二及三级质谱的图形完全一致。可以肯定,L-色氨酸是胃癌患者胃液中特异性荧光物质的组成成分。14整理ppt讨论质荷比为217的物质也有可能参与荧光峰的形成。且其二级及三级质谱与L-色氨酸一致。故疑心它为一种与L-色氨酸相类似的物质,其实际相对分子质量为216。但因缺乏与本质谱配套的解析标准谱库,目前无法进一步搞清其结构。15整理ppt讨论对质谱图中其他峰代表的物质,也还应明确其结构及荧光特性。对高效液相保存时间在3.5～4.5min的物质,尚有待进一步确认。16整理ppt结论本实验尝试联合使用高效液相和质谱技术来分析胃液中一种肿瘤标志物的方法。对新的胃癌肿瘤标志物的发现起铺垫作用,具有广泛的应用前景。对揭示肿瘤发生、演进及代谢的生化过程有可能起关键作用。17整理ppt李渊,林三仁,周丽雅,彭嘉柔,郭慧兰.胃癌患者胃液中特异性荧光物质的初步确定[J].中华消化杂志,2003,01:11-14.18整理pptThree

aromaticaminoacids

in

gastricjuice

aspotentialbiomarkersfor

gastric

malignancies19整理pptBACKGROUNDForscreeningearly-stage

gastric

malignancies,theexistingserumbiomarkershavelimitedsensitivityandspecificity.

Gastricjuice

biomarkersarescarceandrequirefurtherinvestigation.20整理ppt研究背景对于筛查早期胃恶性肿瘤，现存的血清学生物标志物在敏感性和特异性方面都有其局限性。胃液生物标志物稀缺，需要进一步调查。21整理pptOBJECTIVEWedividedthisstudyonsearchingpotentialbiomarkersintofourparts:(1)detectionofdifferentialspectroscopyandHPLC,(2)identificationandvalidationofdifferentialpeaksusingLC/MSandNMR,(3)quantificationofpotentialbiomarkers,and(4)establishmentofdiagnosticdetection.

22整理ppt研究目的我们将这个筛选潜在的生物标记物的研究分为四个局部：〔1〕联合使用荧光光谱和高效液相色谱法检测良恶性胃病患者胃液荧光光谱；〔2〕使用液相/质谱和核磁共振的方法来识别和验证良恶性胃病患者胃液荧光光谱的区别；〔3〕定量研究潜在的生物标记物；〔4〕建立诊断检测。23整理pptMETHODSInthisstudy,discriminatingfluorescencebiomarkerswereisolatedandidentifiedfromgastricjuicebyusinghigh-performanceliquidchromatography(HPLC)andliquidchromatography/massspectrometry(LC/MS),andvalidatedusingnuclearmagneticresonance(NMR).24整理ppt研究方法本研究中应用高效液相(HPLC)，液相/质谱〔LC/MS〕的方法，别离并识别差异的胃液荧光标志物，并且用核磁共振〔NMR〕的方法进行了验证。25整理pptRESULTSThefluorescencespectroscopyofdilutedgastricjuiceindicatesthattheFIofP1frompatientswithgastricmalignancieswassignificantlydifferentfromthatinpatientswithbenigngastriclesions(Fig.1aandb).26整理ppt研究结果稀释胃液固有荧光光谱说明，胃恶性肿瘤患者FIP1与胃良性病变者明显不同〔图1A，B〕。27整理pptFig.1.Discoveryoffluorescencebiomarkers.图1荧光标志物的发现Fluorescenceemissionspectra(excitationat288nm)ofdilutedgastricjuicefromthebenign(a)andmalignant(b)groups.稀释胃液的荧光激发光谱(激发光波长为288纳米)，良性(a)和恶性(b)组。28整理pptRESULTSHPLCwasusedforthediscoveryofvaluablebiomarkersinthegastricjuice.ThechromatogramsareshowninFig.1c–f.Bycomparingthechromatogramsforthebenignandmalignantgroups,thediscriminatingbiomarkerscouldbeassociatedwithpeaksI,II,IIIandIV,whichwereelutedaround8,12,16.5and33min,respectively.29整理ppt研究结果采用高效液相色谱法测定胃液中有价值的生物标志物。色谱图如图1c–f所示。对良性组和恶性组色谱图进行比较，有助于鉴别I，II，III和IV相关峰的生物标志物，它们的洗脱时间分别约为8，12，16.5和33分钟。30整理pptFig.1.Discoveryoffluorescencebiomarkers.图1荧光标志物的发现Fluorescencechromatograms(λex=288nm,λem=360nm)ofgastricjuicefrombenign(c)andmalignant(d)groups.稀释胃液的荧光质谱图(激发光波长为288纳米，发射光波长为360纳米)，良性(c)和恶性(d)组。31整理pptFig.1.Discoveryoffluorescencebiomarkers.图1荧光标志物的发现UVchromatograms(λ=205nm)ofgastricjuicefrombenign(e)andmalignant(f)groups.稀释胃液的紫外质谱图(激发光波长为205纳米)，良性(e)和恶性(f)组。32整理ppt33整理ppt34整理pptRESULTSThefluorescenceintensity(FI),tyrosine,phenylalanine,tryptophanandtotalproteincontentweresignificantlyhigherinthe

gastricjuice

ofpatientswith

gastricmalignancies(allP<0.01).35整理ppt研究结果胃恶性肿瘤患者胃液中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的荧光强度(FI)和血清总蛋白含量明显高于胃良性病变患者(P值均<0.01)。36整理pptFig.2.(a)Scatterplotindicatesvaluesoftyrosine,phenylalanine,tryptophan,totalproteinandFIingastricjuicefrombenignandmalignantgroups.图2〔a〕散点图显示良性和恶性病变组患者胃液中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、总蛋白和荧光强度〔FI〕值。37整理pptRESULTSWithallP<0.001,theareasunderthereceiveroperatingcharacteristiccurvesofthebiomarkersweretyrosine,0.838;phenylalanine,0.856;andtryptophan,0.816.Ataspecificityof79.4%,thesensitivityfor

gastric

malignancydetectionwithphenylalanine

was87.9%only.38整理ppt研究结果在所有P<0.001的生物标志物中,受试者工作特征曲线〔ROC〕下面积分别是:酪氨酸,0.838;苯丙氨酸,0.856;色氨酸,0.816。在特异性为79.4%时，苯丙氨酸用于胃恶性肿瘤检测的灵敏度为87.9%。39整理pptFig.2.(b)ROCcurvesfordetectionofgastricmalignancieswereplottedwiththeuseoftyrosine(Tyr),phenylalanine(Phe),tryptophan(Trp),proteinandFI.图2〔b〕使用酪氨酸(Tyr),苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp),总蛋白和荧光强度〔FI〕绘制的受试者工作特征〔ROC〕曲线用于检测胃恶性肿瘤。40整理pptDISCUSSIONSTheelevationofaromaticaminoacidsingastricjuicemaybeexplainedasfollows.First,malignantcellsareextremelyinvasive,andtheycansynthesizeandsecretemanyenzymes(e.g.,matrixmetalloproteinases,MMPandproteinases)thatcoulddegradethebasementmembraneandextracellularmatrix.41整理ppt讨论胃液芳香族氨基酸升高的机制如下：首先，恶性细胞的侵袭性极强，它们可以合成并分泌许多酶类〔例如，金属基质蛋白酶MMP和蛋白酶〕降解基底膜和细胞外基质。42整理pptDISCUSSIONSCollagenfibersandelastincontainendogenousfluorophores(aromaticaminoacidresidues),whichhavefluorescenceproperties,andarerichinthebasementmembraneandtheextracellularmatrix.Therefore,theelevationofaromaticaminoacidsingastricjuicemightbeaphenomenonthatresultsfromdegradationofbasementmembraneandextracellularmatrix.43整理ppt讨论胶质纤维和弹性蛋白包括内源性荧光物质〔氨基酸残留物〕，在细胞基底膜和细胞外基质的含量丰富。因此，胃液氨基酸含量的升高可能预示着基底膜和细胞外基质的降解。44整理pptDISCUSSIONSSecond,duetoincreasedproteinsynthesisandrapidgrowth,moreessentialaminoacids(especiallyforaromaticaminoacids)maybeup-regulatedinmalignanttissue.Somecellsshowexfoliationornecrosisandreleasecytoplasmenrichedwithessentialaminoacids,whichcouldenhancethearomaticaminoacidslevelsingastricjuices.

45整理ppt讨论第二，因为恶变组织蛋白质合成增加，生长加快，所以需要上调必须氨基酸〔尤其是芳香族氨基酸〕的表达。一些脱落或坏死的细胞释放必需氨基酸含量丰富的细胞基质，可以提高胃液芳香族氨基酸的水平。46整理pptDISCUSSIONSThird,excessreactiveoxygenspecies(ROS)producedduringchronicimmuneactivationaroundtumortissuemayinterrupttheconversionofphenylalaninetotyrosine.Hence,thephenylalanineconcentrationincreases.Moreover,amino-acid-metabolizingenzymes(e.g.,indoleamine2,3-dioxygenaseandmonoamineoxidase)thatareexpressedaberrantlyinmalignantcells,mayaffectthearomaticaminoacidslevelsingastricjuice.

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