Kibra和aPKC在中枢神经系统发育中的表达及意义

目录一、摘要1中文摘要 12英文摘要 4二、正文1前言 62材料与方法 83结果3.1HE染色结果 113.2Kibra结果 123.3aPKC结果 194讨论 265结论 276参考文献 28三、综述1综述 312结语 413参考文献 42四、致谢 48Kibra和aPKC在中枢神经系统发育中的表达及意义中文摘要概述Kibra是一个含有WW结构域，表达于肾脏和脑组织的蛋白质。通过基因组单核苷酸多态性筛选证实，Kibra参与了人类记忆认知功能。大量研究表明，Kibra表达在记忆相关的脑组织区域；在记忆提取的过程中，Kibra等位基因会发生明显改变；Kibra与CLSTN2表达在记忆相关区域内颞叶部位参与情节记忆的形成，与阿尔默海茨病病因有关。但是Kibra在脑组织中的表达部位以及在胚胎发育过程中Kibra表达部位和表达水平的变化与记忆形成的关系尚不明确。PKC（蛋白激酶C）作为一个苏氨酸-丝氨酸家族蛋白，参与了机体很多的生理性和病理性过程。如：脑组织的发育、突触的可塑性、癫痫病、脑缺血以及神经细胞的死亡。aPKC(非典型蛋白激酶C)为蛋白激酶C家族中的一个类型，可以分为三个亚型，PKCζ、PKCλ/ι、PKMζ。这些亚型在突触可塑性和神经变性疾病中发挥了重要的作用。它们介导胞外信号调节的激酶级联反应，P70S6激酶信号级联反应，参与肿瘤的发生，细胞极性的形成以及记忆的长时程增强。大脑记忆的主要功能区域在海马，其次为颞叶和小脑，因为Kibra和PKC在胚胎发育脑组织中的具体表达部位及其意义还未阐明，如果能证实它们表达于大脑这些与记忆相关的区域，能为记忆形成的机理研究打下一定基础。同时,最近研究发现，Kibra与PKC关系密切，可能是PKC磷酸化的底物。本研究以大鼠不同发育时期的脑组织（不同胚胎期、新生、成年）为研究对象,通过HE染色了解脑组织的基本结构和细胞形态；阴道抽液法确定受孕日期；免疫组织化学方法检测Kibra和aPKC在不同时期脑组织中的表达，从而探讨二者在突触可塑性和记忆形成的联系。结果显示：1、Kibra在大脑皮层、海马、小脑的细胞核中表达；在10d、12d表达阴性，14d表达弱阳性，16d、18d、新生、成年大鼠阳性表达逐渐增强。2、aPKC在大脑皮层、海马、小脑细胞的细胞连接处表达，且在各个时期脑组织均为阳性表达。目的1、掌握了解大鼠脑组织的形态结构和组织特点。2、研究Kibra和aPKC在不同时期的大鼠脑组织中的表达。3、初步探讨Kibra和aPKC在大脑记忆形成中的相关性。方法1、将雌雄成年鼠合笼，阴道抽液确定怀孕日期（检查到精子记为怀孕0.5天）。2、收集不同时期（胚胎第10d，12d，14d，16d，18d，20d）胚胎鼠、新生鼠及成年鼠各两只，共16只，分别标记、取脑组织。3、固定标本并切片（做冰冻切片和石蜡切片二种），HE染色、同一时期的大鼠脑组织分别用ABC三步法免疫组织化学法进行Kibra和aPKC染色。结果1、Kibra在大脑皮层、海马、小脑的细胞质中表达；在胚胎10d、12d表达阴性；胚胎第14d在大脑皮层表达弱阳性，胚胎第18d在大脑皮层表达阳性，海马区表达弱阳性；新生鼠在大脑皮层、海马、小脑的浦肯野细胞中表达阳性。随着胚胎的发育，表达逐渐增强。2、aPKC自胚胎第10d在大脑皮层、海马、小脑细胞的细胞连接处表达阳性且均在各个脑组织时期表达阳性，随着胚胎发育，表达有逐渐增强的趋势。结论1、Kibra较aPKC晚表达于脑组织中，Kibra在脑组织中的表达随胚胎发育逐渐增强，表达区域逐渐扩大。2、aPKC在自胚胎早期即表达于脑组织，说明是脑组织发育不可缺少的成分。3、Kibra和aPKC自新生后均在脑组织海马、大脑皮层和小脑中表达，提示了二者可能存在潜在的相互作用和联系，参与了记忆的形成。关键词：记忆形成；脑组织；Kibra；aPKC;免疫组化；HE染色ExpressionandsignificanceofKibraandaPKCincentralnervoussystemduringembrynicdevelopmentCandidate:ZhouJin’anSupervisor:Prof.DuanYaqiTongjiMedicalCollege,HuazhongABSTRACTSummarizeTheKibrageneencodesacytoplasmaticprotein,amemberofthesignaltransductionproteinfamily,expressedmainlyinthebrain.RecentstudieshaveimplicatedtheinvolvementofageneticvariationintheKIBRAgene(Tallele)inhumanmemoryinnormalsubjectsandintheriskofdevelopingAlzheimer'sdisease(AD).PROTEINKINASEC(PKC)isanintegralpartinthecellsignalingmachinery.Biochemicalandmolecularcloninganalysishasrevealedthat,likemostothersignalingproteins,theenzymecomprisesalargefamilywithmultipleisoformsexhibitingindividualcharacteristicsanddistinctpatternsoftissuedistribution.Thebiologicalsignificanceofthisheterogeneityhasnotbeenfullyclarified,butthefunctionofeachPKCisoformforcellularregulationisbeinginvestigatedextensively.Presently,thepossibilitymaynotberuledoutthatsomeisoformsrepresentsimplyaredundancy,butplausibleevidencesuggeststhatthemembersofthisenzymefamilyareactivatedinspecificintracellularcompartmentsindifferentways,dependingonvariousmembranelipidmetabolites,andplaydistinctrolesforthecontrolofmajorcellularfunctions.ObjectiveTheaimofourstudywastoinvestigatethemorphologicalstructureandfeaturesoforganizationinbraintissues.TheexpressionofKibraandaPACinbraintissuesweredetectedaswell.MethodsThefemaleandmaleratswerematedanddatesofpregnantwereconfirmedbyvaginalfluid.Thebraintissuesoffetusesrats(10d,12d,14d,16d,18d,20d),neonatalratsandadultratsatdifferentstageswerecollected.Routinelyprocessed4%formamint-fixed,frozensectionsandparaffin-embeddedblockswerearchived.KibraandaPKCwerestainingbyHEandABCimmunohistochemicalmethods.ResultsKibrawasexpressedinthenucleiofcerebralcortex,hippocampusandepencephalon.TheexpressionlevelsofKibrawerenegativeonday10,12,weaklypositiveonday14.Theexpressionlevelwasgraduallyincreasedinneonatalratsandadultrats.TheexpressionofaPKCwaspositiveintheadherensjunctionsofcerebralcortex,seahorseandepencephalonatdifferentperiodofbraintissues.Conclusion1、Inbraintissues,theexpressionofKibraislaterthanaPKC.TheexpressionlevelandareaofKibraincreaseswiththeembryonicdevelopment.2、aPKCisanindispensablecomponentofbraindevelopmentbecauseitexpressesinbraintissueinearlyembryon.3.ColocalizationofKibraandaPKCinthecerebralcoretex,hippocampusandcerebellummayimplicatetheirrolesinmemoryformation.Keywords:engraphia;Kibra;aPKC;immunohistochemistry;HEstainingKibra和aPKC在中枢神经系统发育中的表达及意义前言人类记忆的形成在神经生物界至今是一个谜。一些研究者对记忆的获得、维持和再现的机制仍在寻求答案。记忆的形成是一个高度复杂的过程，需要各种蛋白质分子的相互作用参与。其中，情节记忆是人类对过去特定的时间特定经验信息的一个储存ADDINNE.Ref.{67EDEBCA-ECC8-4248-ABBD-1E96527FE154}[1]。情节记忆50%是由遗传获得ADDINNE.Ref.{AAAB2BD6-5DAD-48BE-8D2E-C08FD0C87EC6}[2]，但是个体情节记忆的遗传差异的机制尚不清楚。动物实验研究表明，个体间的记忆遗传差异归功于记忆形成过程中记忆相关信号分子ADDINNE.Ref.{CDF4B773-BC5B-49BB-AF56-9BCD8249EBCC}[3]。在这些相互作用的分子中，Kibra是一个近期研究比较热门的分子，通过运用单核苷酸多态性的基因组相关研究表明，Kibra与人类情节记忆有关。最近的研究结果也一再显示了Kibra在记忆形成过程中的重要性ADDINNE.Ref.{A0641C64-9BAC-40BA-83FF-7989D6C7EAC3}[4,5]。Kibra是一个含有WW-结构域的蛋白分子，表达于肾脏和脑组织中ADDINNE.Ref.{5C3830BB-45C2-4C2D-8C14-EDDD61B5953C}[6]。在海马及颞叶这些与记忆高度相关的区域高度表达ADDINNE.Ref.{9BEA9573-B6CA-46BC-9DA2-67887DD1DDEA}[7,8]。Kibra被证实涉及到情节记忆形成的过程中，如信号转导，突触可塑性，长时程增强及突触传递ADDINNE.Ref.{C621A9B9-D7CA-4E9C-80A2-E0B4FAAA2DDF}[6,7,9]。Kibra还通过与多种分子相互作用参与到多种生理功能中，如：信号传导、细胞极性的分化、细胞的迁移、囊泡递质的运输、转录的调节ADDINNE.Ref.{75EC50C7-82F8-4E48-A273-5A1EDFF15559}[10]等。在乳腺癌MCF7细胞中Kibra还与DLC1共同激活雌激素受体ADDINNE.Ref.{A3B68FE1-2A25-4407-BD28-036BB997803D}[11]，对乳腺癌的治疗、预后有一定的指导意义。PKC是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族的一个成员，通过磷酸化反应来调节许多的细胞功能ADDINNE.Ref.{82EC5496-E1A6-440F-9ED4-EDD5C25A3994}[12]。根据其结构和功能将PKC分为12种亚型。aPKC由于缺少Ca离子和二酰甘油结合区，故激活机制不同于其他PKC。aPKC可分为三种亚型：PKCζ、PKCλ/ι、PKM。三者的结构如综述图1所示。aPKC包含调节区和催化区二个结构域，PKCζ、PKCλ/ι在催化区有高度相关性，研究发现，这二种亚型在基因敲除小鼠不同表型中发挥的作用是不同的。敲除PKCλ/ι的小鼠由于胚胎早期细胞极性的缺陷在胚胎期死亡，而敲除PKCζ的小鼠却可以存活。说明，在胚胎发育中PKCλ/ι对细胞极性的建立至关重要，而PKCζ不参与这个过程ADDINNE.Ref.{C31D2021-AEE5-45E9-B029-796054F2E6C3}[13]。在各种细胞中，PKCζ参与MAPK级联反应；活性突变的PKCζ活化MAPK激酶MEK1和ERK1ADDINNE.Ref.{2A1BEEEA-1A2C-44D8-83AE-DD86D1A37EFC}[14-17]；野生型PKCζ的过度表达激活ERK1和ERK2，增加EIK1的转录活性；参与受体信号复合物到NFκB转录因子的活化ADDINNE.Ref.{70FDFEA7-E569-481C-B475-2D5DD21BDD3D}[18,19]和P70S6激酶信号及级联反应ADDINNE.Ref.{C986ECD5-2DE7-4E55-9FBA-D6D5E2D6FA6B}[20,21]等。PKCλ/ι在一些恶性肿瘤如非小细胞肺癌和卵巢癌中异常表达，持续过度表达可导致细胞极性、粘附作用丧失，与肿瘤的转移、发展、预后有一定的关系ADDINNE.Ref.{A15B1049-4306-4D65-919B-72D87360307B}[22,23]。而PKM只含有催化区，是一个截短型的aPKC分子ADDINNE.Ref.{539AC6CD-3536-4725-B29A-F376F0093BA7}[24]，一旦产生，就始终处于激活状态。研究表明，PKM在长期记忆的维持和海马长时程增强中发挥了重要作用，是一个必不可少的分子ADDINNE.Ref.{E5A8B35E-8E3E-4E70-8112-27BA6365FC86}[25]。本实验旨在研究Kibra和aPKC在不同鼠脑组织发育过程中的表达部位，通过初步探讨二者的表达，为进一步研究二者间的相互作用提供定位依据。一些实验研究表明：Kibra和aPKC通过与不同分子的相互作用共同参与信号通道中，发挥相同的功能。Kibra作为aPKC磷酸化的底物这是至今唯一明确的关于二者直接相互作用的研究发现。如果Kibra被PKC磷酸化后参与记忆的形成，那么通过对Kibra及PKC在胚胎发育过程中定位的研究，可以部分揭开两者神秘关系的面纱。材料和方法一材料（一）动物成年健康250g左右SD大鼠24只：购于华中科技大学同济医学院动物实验中心（二）试剂1.Kibra及aPKC抗体购于美国Santacruz公司，最终稀释浓度：Kibra为1：200，aPKC为1:1000。2.4%多聚甲醛：称取40g多聚甲醛,加热至60℃左右的蒸馏水约400ml，搅拌,加入少量的1MNaOH溶液，搅拌至完全溶解（一直保持60℃的温度）；加入0.2M的PBS500ml，冷却后过滤，蒸馏水定容至1000ml。PH值调至7.2-7.4，放入4℃冰箱预冷，现配现用。3.0.2MPBS：(1)Na2HPO4·12H2O5.67g溶于200ml蒸馏水(2)NaH2PO4·2H2O1.56g溶于50ml蒸馏水，4.免疫组化用PBS：Na2HPO4·12H2O14.4999g、NaH2PO4·2H2O1.482g、Nacl45g溶于5L蒸馏水中，调PH至7.4。5.30%蔗糖：（1）称取14.2Na2HPO4·12H2O14.2g溶于100ml蒸馏水中，（2）称取NaH2PO4·2H2O12g溶于100ml中，分别取（1）72.9ml和（2）27.1ml混合，加入30g蔗糖溶解其中，现配现用。6.OCT包埋剂：购于美国SAKURA产品。7.ABC试剂：购于北京中杉金桥免疫组化专用ABC试剂盒。8.95%乙醇：950ml无水乙醇，50ml双蒸水。9.90%乙醇：900ml无水乙醇，100ml双蒸水。10.80%乙醇：800ml无水乙醇，200ml双蒸水。11.抗原修复液：0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml），柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g，混匀。12.3%H2O2：30%H2O2，PBS按体积1:10比例混合13.DAB：购于美国R&DSystems公司。14.1%盐酸酒精：75%的酒精100ml+1ml浓盐酸（三）主要仪器HPIAS－1000型图像分析系统。二方法（一）获取胎鼠脑组织(1)获取胎鼠：第一天下午17:30以2:1的比例雌雄合笼，于次日9点前进行阴道抽液并涂片，镜下观察精子，记录阴道涂片有精子的雌鼠进行标记并记录为妊娠0.5天。(2)待胎鼠孕育到所需天数后麻醉孕鼠剖腹取出胎鼠，麻醉，断头。冰上分离其脑组织。(3)获取新生鼠及成年大鼠的脑组织：取新生鼠及250g成年大鼠，麻醉，剪开胸腔，暴露心脏。从心尖处将灌流针插入左心室，剪开右心耳。先灌以少量生理盐水，再用4%多聚甲醛灌流。待新生鼠四肢抽搐，僵硬，变白后，断头取脑，冰上分离脑组织。(4)脑组织的处理及后固定：以上脑组织分离后分别投入4%多聚甲醛过夜，后转入30%的蔗糖中。待沉底后，OCT包埋，液氮速冻一分钟，放置-70℃冰箱保存。所有标本收集齐后，进行脑组织切片。(5)脑组织切片：将标本进行石蜡包埋，从平行大脑中线面进行矢状切片，片厚5μm，每5张取一张。烤片过夜，待染色。（二）HE染色步骤（1）脱蜡：二甲苯脱蜡10mins×2。（2）水化：100%酒精，95%酒精，75%酒精依次放置5mins。（3）自来水冲洗后过双蒸水，1min。（4）苏木素染色5min后，充分自来水冲洗1min；将玻片表面苏木素冲净然后过盐酸酒精分化10s。（5）流水冲洗，观察染色是否充分。（6）伊红染色20秒，然后用无水酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脱水，2min/次。（7）吹干，中性树胶封片。（三）免疫组化采用S-P法染色步骤(1)石蜡切片脱蜡至水：二甲苯10mins，二甲苯10mins，二甲苯5mins，95%酒精5mins，80%酒精5mins，75%酒精5mins，蒸馏水2mins。（2）高压锅抗原修复：加入枸橼酸钠修复液，冒气时开始计时1分30秒。（3）3%过氧化氢室温孵育10mins，以消除内源性过氧化物酶的活性。（4）自来水冲洗1min。（5）PBS5mins×3。（6）加A液37℃30mins，（7）甩掉切片上的A液，滴加用血清稀释好的一抗，4℃过夜。（8）自来水洗1mins。（9）PBS5mins×3。（10）加B液，37℃20mins。（11）自来水洗1mins。（12）PBS5mins×3。（13）加C液，37℃20mins。（14）自来水洗1mins。（15）PBS5mins×3。（16）滴加二抗，37℃30mins。（17）自来水洗1mins。（18）苏木素复染，透明，封片。（四）结果的阅读和分析本实验结果由一名经验丰富的技师指导染色，经过二名同济医院副高以上专家阅片，采用HPIAS－1000型图像分析系统获取图片，结果真实可靠。结果一、HE染色：脑组织的正常形态结构。图1-1成年鼠脑组织HE染色（20×）图1-2成年鼠脑组织HE染色(海马400×)图1-3成年鼠脑组织HE染色(小脑400×)二、Kibra结果Kibra自胚胎第14天在大脑皮层表达弱阳性；胚胎第18天在大脑皮层表达阳性，海马区表达弱阳性；新生鼠在大脑皮层、海马、小脑的浦肯野细胞中表达阳性。1、在大鼠胚胎发育的第10d，其脑组织为神经管，Kibra染色结果为阴性（见图2-1）。图2-110d胎鼠脑组织免疫组化结果示Kibra的表达（20×）；2、在大鼠胚胎发育的第12d，脑组织Kibra染色结果为阴性（见图2-2）。图2-212d胎鼠脑组织免疫组化结果示Kibra的表达（20×）；3、在大鼠胚胎发育的第14d，大脑皮层Kibra染色结果为阳性（见图2-3箭头所指处）。4、在大鼠胚胎发育的第16d，大脑皮层Kibra染色结果为阳性，着色较第14d稍深（见图2-4箭头所指处）。5、在大鼠胚胎发育的第18d，大脑皮层Kibra染色结果为阳性，海马区Kibra染色结果为阳性（见图2-5箭头所指处）。6、新生鼠免疫组化结果示Kibra在大脑皮层、海马、小脑中的表达均为阳性（见图2-6、图2-11，图2-6箭头所指处从左到右分别为小脑、海马、大脑皮层；图2-11示新生鼠小脑）。7、成年鼠免疫组化结果示Kibra在大脑皮层、海马、小脑中的表达均为阳性，并且着色较前都有明显加深（见图2-7、2-8、2-9、2-10）。图2-314d胎鼠脑组织免疫组化结果示Kibra的表达（20×）；图2-416d胎鼠脑组织免疫组化结果示Kibra的表达（20×）；图2-518d胎鼠脑组织免疫组化结果示Kibra的表达（20×）；（左侧箭头示大脑皮层，右侧箭头示海马区）图2-6新生鼠免疫组化结果示Kibra在大脑皮层、海马、小脑中的表达（20×）；图2-7成年鼠免疫组化结果示Kibra在大脑皮层、海马中的表达（20×）；AA图2-8图2-7中A部分示Kibra在大脑皮层表达阳性（100×）BB图2-9图2-7中B部分示Kibra在海马及齿状回表达阳性（100×）C字形为CA区，W形为齿状回区CC图2-10图2-7中C部分示Kibra在海马区表达阳性（400×）DD图2-11图2-7中D部分Kibra在小脑浦肯野表达阳性（100×）三、aPKC结果：1、aPKC在细胞与细胞连接处出现棕黄色颗粒为阳性表达。aPKC在大脑皮层，海马，小脑中表达阳性。2、aPKC在在10d、12d、14d、16d、18d、20d、新生、成年表达均阳性（见图3-1、图3-2、图3-3、图3-4、图3-5、图3-6、图3-7、图3-8、图3-9、图3-10、图3-11、图3-12），强度随生长发育的过程有逐渐增强的趋势。图3-110d胎鼠脑组织免疫组化结果示aPKC的表达（20×）；图3-212d胎鼠脑组织免疫组化结果示aPKC的表达（20×）；图3-314d胎鼠脑组织免疫组化结果示aPKC的表达（20×）；图3-415d胎鼠脑组织免疫组化结果示aPKC的表达（20×）；图3-516d胎鼠脑组织免疫组化结果示aPKC的表达（20×）；图3-618d胎鼠脑组织免疫组化结果示aPKC的表达（20×）；图3-720d胎鼠脑组织免疫组化结果示aPKC的表达（20×）；图3-8新生鼠（左）和成年鼠（右）脑组织免疫组化结果示aPKC的表达（20×）；图3-9图3-8中E部分免疫组化结果示aPKC在海马的表达（100×）；图3-10图3-8中F部分免疫组化结果示海马区aPKC的表达（400×）；图3-11图3-8中G部分免疫组化结果示aPKC的表达（400×）（注：周边一圈棕染细胞为浦肯野细胞）图3-12图3-8中H部分免疫组化结果示aPKC在大脑皮质的表达（100×）；讨论记忆的形成是一个比较复杂的过程，大脑记忆主要部位已经被证实为海马区，其次为大脑皮层和小脑，这些部位蛋白的表达与记忆必定存在一定联系。Kibra在人类肾脏和脑组织中高度表达。它第一个被证实与记忆行为有着直接联系的支架蛋白。与记忆相关基因筛选表明，Kibra基因第九个内含子上的单核苷酸多态性与情节记忆有关ADDINNE.Ref.{B31C2105-CBDD-4375-8341-09D5271F7CE4}[26]。Kibra蛋白质表达在细胞质，含有二个与富含脯氨酸靶分子结合的WW结构域，一个感应Ca离子的类似C2区ADDINNE.Ref.{001F596E-5B44-44FE-A4CB-BEA7E5D479B9}[27]及位于羧基端富含谷氨酸的区域ADDINNE.Ref.{9AB42464-2A24-4F67-928A-7E648E1879FB}[28]。本实验显示kibra在细胞质表达，特别是核周表达丰富，它在细胞质的定位说明kibra不参与RNA剪切及转录等一系列细胞核蛋白的功能中。免疫组化结果表明kibra在记忆相关区域海马CA1，CA2，CA3，齿状回，大脑皮层，小脑，下丘脑高度表达，参与了记忆的形成。为一些神经代谢紊乱疾病和阿尔默海茨病提供了病因依据。aPKC分为三种亚型PKCζ、PKCλ/ι、PKMζ，大量研究表明PKMζ参与了长时程增强和长时程抑制过程ADDINNE.Ref.{14FB3CED-94FA-40D2-9476-3CF18AACE495}[29]，毋庸置疑的是这三者均为记忆认知形成过程中的重要分子ADDINNE.Ref.{51E066FE-1F66-450F-9DF7-5F50B314CEE5}[30]。PKCλ/ι在胚胎细胞极性形成过程中发挥了重要作用，胚胎发育时PKCλ/ι表达缺陷可导致胚胎的死亡ADDINNE.Ref.{EC112508-7061-44C4-91EF-E371C899EE0C}[31]。PKCζ参与多个信号级联反应，如炎症、免疫反应、细胞凋亡、细胞极性的建立中ADDINNE.Ref.{25196937-68D5-48E3-BB8C-66DD79C47669}[32]。本试验中，aPKC在海马，大脑皮质，小脑这些部位表达显著，在一定程度上与胚胎神经发育、记忆形成有关。aPKC在Dishevelled分子作用下促进轴突的分化，在神经发育中有着关键的作用ADDINNE.Ref.{BD41064A-3144-467B-8DDA-5C106C7E6CA1}[33]。在亚细胞水平，aPKC在细胞联合部位表达阳性，显示aPKC在细胞极性建立中的重要性。但是aPKC在各种功能中形成复合物后下游调控的目的分子和调控这些分子后产生的详细机制和功能，以及细胞极性维持和建立的分子机制、在记忆形成过程的具体机制有待进一步研究和探讨。有研究报导，Kibra和aPKC通过与不同分子的相互作用共同参与信号通道中，发挥相同的功能。Kibra作为aPKC磷酸化的底物这是至今唯一明确的关于二者直接相互作用的研究发现。本研究中，在小鼠胚胎发育到14天后，Kibra在大脑皮层开始表达，而后随着胚胎的发育逐渐表达增强，区域逐步扩展到海马、小脑。自Kibra完全表达后，其和aPKC在脑组织中表达的部位均为大脑皮层、海马、小脑这三个与记忆明确相关的区域。Kibra在14d后开始表达至成年表达逐渐增强，可能说明脑组织发育到一定阶段，通过Kibra的出现，在一系列分子机制下激活aPKC，处于激活状态的aPKC作用于Kibra，使14d后的脑组织Kibra的表达呈现出逐渐增强的阳性表达。aPKC自胚胎发育的第10天即广泛表达于脑组织中，说明其是脑组织生长发育和记忆形成中不可缺少的分子。由此，经过我们初步探讨这二者在脑组织中的表达部位，为进一步研究它们的相互作用机制提供了一个出发点。结论1、Kibra较aPKC晚表达于脑组织中，Kibra在脑组织中的表达随胚胎发育逐渐增强，表达区域逐渐扩大。2、aPKC在自胚胎早期即表达于脑组织，说明是脑组织发育不可缺少的成分。3、Kibra和aPKC自新生后均在脑组织海马、大脑皮层和小脑中表达，提示了二者可能存在潜在的相互作用和联系，参与了记忆的形成。参考文献Tulving,E.,Episodicmemory:frommindtobrain.AnnuRevPsychol,2002.53:p.1-25.Bouchard,T.J.andM.McGue,Geneticandenvironmentalinfluencesonhumanpsychologicaldifferences.JNeurobiol,2003.54(1):p.4-45.Neuropsychiatry,2009.14(4-5):p.356-76.Nacmias,B.,etal.,KIBRAgenevariantsareassociatedwithepisodicmemoryperformanceinsubjectivememorycomplaints.NeurosciLett,2008.436(2):p.145-7.Almeida,O.P.,etal.,KIBRAgeneticpolymorphisminfluencesepisodicmemoryinlaterlife,butdoesnotincreasetheriskofmildcognitiveimpairment.JCellMolMed,2008.12(5A):p.1672-6.Kremerskothen,J.,etal.,CharacterizationofKIBRA,anovelWWdomain-containingprotein.BiochemBiophysResCommun,2003.300(4):p.862-7.Johannsen,S.,etal.,Temporal-spatialexpressionandnovelbiochemicalpropertiesofthememory-relatedproteinKIBRA.Neuroscience,2008.155(4):p.1165-73.Papassotiropoulos,A.,etal.,CommonKibraallelesareassociatedwithhumanmemoryperformance.Science,2006.314(5798):p.475-8.Buther,K.,etal.,KIBRAisanovelsubstrateforproteinkinaseCzeta.BiochemBiophysResCommun,2004.317(3):p.703-7.Schneider,A.,etal.,KIBRA:ANewGatewaytoLearningandMemory?FrontAgingNeurosci,2010.2:p.4.Rayala,S.K.,etal.,EssentialroleofKIBRAinco-activatorfunctionofdyneinlightchain1inmammaliancells.JBiolChem,2006.281(28):p.19092-9.Nishizuka,Y.,ProteinkinaseCandlipidsignalingforsustainedcellularresponses.FASEBJ,1995.9(7):p.484-96.Leitges,M.,etal.,TargeteddisruptionofthezetaPKCgeneresultsintheimpairmentoftheNF-kappaBpathway.MolCell,2001.8(4):p.771-80.Berra,E.,etal.,EvidenceforaroleofMEKandMAPKduringsignaltransductionbyproteinkinaseCzeta.EMBOJ,1995.14(24):p.6157-63.Fernandez,N.,etal.,AtypicalproteinkinaseC-zetastimulatesthyrotropin-independentproliferationinratthyroidcells.Endocrinology,2000.141(1):p.146-52.Schonwasser,Monick,M.M.,etal.,ProteinkinaseCzetaplaysacentralroleinactivationofthep42/44mitogen-activatedproteinkinasebyendotoxininalveolarmacrophages.JImmunol,2000.165(8):p.4632-9.Sanz,L.,etal.,Theinteractionofp62withRIPlinkstheatypicalPKCstoNF-kappaBactivation.EMBOJ,1999.18(11):p.3044-53.Sanz,L.,etal.,TheatypicalPKC-interactingproteinp62channelsNF-kappaBactivationbytheIL-1-TRAF6pathway.EMBOJ,2000.19(7):p.1576-86.Akimoto,K.,etal.,AtypicalproteinkinaseClambdabindsandregulatesp70S6kinase.BiochemJ,1998.335(Pt2):p.417-24.Romanelli,A.,V.C.DreisbachandJ.Blenis,Characterizationofphosphatidylinositol3-kinase-dependentphosphorylationofthehydrophobicmotifsiteThr(389)inp70S6kinase1.JBiolChem,2002.277(43):p.40281-9.Regala,R.P.,etal.,AtypicalproteinkinaseCiotaplaysacriticalroleinhumanlungcancercellgrowthandtumorigenicity.JBiolChem,2005.280(35):p.31109-15.Eder,A.M.,etal.,AtypicalPKCiotacontributestopoorprognosisthroughlossofapical-basalpolarityandcyclinEoverexpressioninovariancancer.ProcNatlAcadSciUSA,2005.102(35):p.12519-24.Takai,Y.,etal.,Studiesonacyclicnucleotide-independentproteinkinaseanditsproenzymeinmammaliantissues.I.Purificationandcharacterizationofanactiveenzymefrombovinecerebellum.JBiolChem,1977.252(21):p.7603-9.Pastalkova,E.,etal.,StorageofspatialinformationbythemaintenancemechanismofLTP.Science,2006.313(5790):p.1141-4.Papassotiropoulos,A.,etal.,CommonKibraallelesareassociatedwithhumanmemoryperformance.Science,2006.314(5798):p.475-8.Bai,J.andE.R.Chapman,TheC2domainsofsynaptotagmin--partnersinexocytosis.TrendsBiochemSci,2004.29(3):p.143-51.Kremerskothen,J.,etal.,CharacterizationofKIBRA,anovelWWdomain-containingprotein.BiochemBiophysResCommun,2003.300(4):p.862-7.Hernandez,A.I.,etal.,ProteinkinaseMzetasynthesisfromabrainmRNAencodinganindependentproteinkinaseCzetacatalyticdomain.Implicationsforthemolecular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C（novelPKC、nPKC），它的亚型有δ、ε、η、θ；以及非典型PKC（atypicalPKC、aPKC）包含有ζ、λ/ι、PKMζ三种亚型。同时依据是否对存在Ca2+依赖，分为Ca2+依赖亚型：PKCα和PKCβII以及Ca2+非依赖亚型：PKCδ和PKCε。它们的结构如图3ADDINNE.Ref.{EEACF676-090C-4534-8ED3-2AD015551A93}[21]。图3这三种蛋白激酶cPKC、nPKC、aPKCC端都有一个相对保守的激酶结构域，N端有一个调节区，根据调节区的拓扑结构的不同把蛋白激酶归为不同的类型。cPKC有一个磷脂结合区和Ca离子结合区及富含半胱氨酸的二个锌指结构域，因此cPKC可以被二酰甘油（DAG）（磷脂酶C即PLC通过膜磷脂产生三羧甲基氨基甲烷磷酸肌醇IP3及DAGADDINNE.Ref.{C2FED616-C80F-406F-A9C7-64D87CEF9027}[20]）和Ca离子激活；nPKC不含Ca离子结合区，故对Ca离子不敏感，与cPKC相似的是它们都可以被佛波酯激活ADDINNE.Ref.{D63AC718-A673-43F7-A1C4-1CD23127C21D}[22]，原因在于它们调节区有双锌指结构域的存在ADDINNE.Ref.{15EB8CD6-DDB3-4CD8-97A7-E166A52DC63C}[23]。与前二者相反的是，aPKC由于缺乏Ca离子结合区，也只有一个锌指结构域，所以它对Ca离子和佛波酯都不敏感。除此之外，aPKC还含有一个假底物结合区域（PB1），该区可以识别其他蛋白质的OPCA模体。在aPKC未激活状态下，PB1与自身激酶结构域结合。六PKC的激活机制PKC的激活机制是通过两个过程完成的，即PS从底物结合位置脱落和激酶结构域的磷酸化ADDINNE.Ref.{2EACF9C7-3A5C-4E71-BA73-4A10A60D7A8A}[24]。1、在PS从底物位点脱落过程中一些脂类发挥了重要作用。这些脂类代谢产物如二酰甘油，导致PS从激活位点脱落，PKC处于活化状态。从而使其它蛋白结合到底物结合区，继而发生磷酸化。PKCζ还可以被另一些脂类激活，如磷脂酰肌醇类ADDINNE.Ref.{961AB426-37B9-4E6D-BEED-57698CE1036D}[25]、磷脂酸ADDINNE.Ref.{4ACC38AE-17D3-4B36-9C7F-66439F2435ED}[26]、花生四烯酸以及神经酰胺ADDINNE.Ref.{ADCAEF67-1862-4719-A6FA-6D58F6FF4B4B}[27]。在这些脂类中，PIP3（三羧甲基氨基甲烷磷酸肌醇）是调节PKCζ的中心环节。NaKanishi研究发现PIP3的合成刺激PKCζ的自我磷酸化，PKCζ的磷酸化是aPKC活化的所必需的。进一步说明aPKC同时也受PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）的调节，因为在生长因子介导下，PI3K通过磷脂酰肌醇4、5-二磷酸产生PIP3ADDINNE.Ref.{7AC0D4BD-A69D-4512-9015-0AB317FCB100}[25]。另外，在大鼠的3Y1细胞，在表皮生长因子、血小板来源的生长因子刺激下，诱导P110（P110为PI3K的催化亚基）的过度表达，可以增强PKCλ/ι的活性ADDINNE.Ref.{A9585C70-7340-42E7-8D46-AAE79EB38341}[28]。在活细胞里，如脂细胞、单核细胞，PKCζ和PKCλ/ι的活性也受PI3K的调节ADDINNE.Ref.{A046FE02-C150-44F7-8633-9CBCDED421C0}[29]。PIP3与aPKC的相互作用：PIP3直接与含有PH（普列克底物蛋白同源物）的结构域的分子结合，如：PKB、PDK1。其中PDK1的PH结构域与PIP3有更高的亲和力ADDINNE.Ref.{A4637851-6C82-4435-8FBF-12125F98DB56}[30]。PDK1与PIP3结合后被激活，粘附在AGC激酶（包括蛋白激酶A、C、G）的疏水区，以至于在每个激活回路上的苏氨酸残基被磷酸化ADDINNE.Ref.{87C6D509-5AB1-492C-8B3C-B63712CEDE1E}[31]。aPKC疏水区包括一小段序列，苯丙氨酸-谷氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸，这段小序列与PDK1和PKC相关蛋白激酶连接位点相似ADDINNE.Ref.{9C0E8E84-2780-48F3-AFBB-C633856C4A4F}[32]，在PKCζ的激活回路上，苏氨酸-410位点被PDK1磷酸化ADDINNE.Ref.{636682DA-C57D-4570-997F-9390B1678320}[33]。在胚胎干细胞基因水平上使PDK1缺乏，PKCζ的苏氨酸-410并没有被磷酸化，显著的说明PKCζ是PDK1的生理性底物。若PKCζ的苏氨酸-410突变成丙氨酸，则失去酶活性，若突变成谷氨酸，模仿苏氨酸被磷酸化，使酶保持活性ADDINNE.Ref.{40F6E10E-DF5F-44C1-B5D5-ABE2CE717FB5}[34]，这些表明苏氨酸-410磷酸化对维持PKCζ的活性是至关重要的。所以，PIP3作用于PKCζ的活化有2种方式：1、对PS存在的自我抑制的调节；2、通过PDK1磷酸化激酶位点的间接调节，这二种方式对活化PKCζ都是必须的。2、激酶位点的磷酸化：苏氨酸-560是PKCζ活化开关基序的一个关键残基。研究证明，PKCζ的苏氨酸-410突变后PKCζ可以进行自我磷酸化，而苏氨酸-560突变后不能进行自我磷酸化，说明苏氨酸-560是PKCζ进行自我磷酸化的唯一位点ADDINNE.Ref.{D17A7DC3-0DF7-4F6A-B3E1-1408E922AF53}[35]。具体PKCζ的苏氨酸-560是自己自我调节进行磷酸化还是与其他蛋白分子相互作用进行的磷酸化尚不明了。七aPKC的功能1、参与分裂原活化的蛋白激酶级联反应（MAPK）一些研究表明，在各种细胞中，PKCζ参与MAPK级联反应ADDINNE.Ref.{35830F80-A163-4AEC-9A6D-38B2937F5300}[36-39]。在被肿瘤坏死因子及血清刺激过的猴COS细胞，一个活性突变的PKCζ活化MAPK激酶MEK1和ERK1（细胞外相关酶），但是PKCζ-kn突变型不会产生上述结果。在甲状腺细胞，野生型PKCζ的过度表达激活ERK1和ERK2，增加EIK1的转录活性，EIK1是ERK1和ERK2的靶分子，而甲状腺刺激素不会发挥这种效应。在人肺泡巨噬细胞，脂多糖激活MEK1、ERK1和ERK2但不激活Raf1，在这个基础上，内源性PKCζ被激活从而与MEK1发生联系。PKCζ-PS多肽抑制PKCζ阻断脂多糖的效应，这些说明PKCζ的功能主要是作为MEK1的激酶，但是在Raf1通道中是独立的。另外，PKCζ在MEK5-ERK5通路中发挥了一个连接器的功能。它连接EGF和MEK5结合，从而增加MEK5的活性。2、参与受体信号复合物到NFκB转录因子的活化从细胞生长及存活的信号中，细胞外配体如TNF-α、IL-1、NGF，来自受体复合物的信号通道的调节到转录因子介导的目的基因的表达如NFκB，NFκB对这些因子起到了非常重要的作用。NFκB在细胞的生存和分化中起到了关键性的作用，特别是在细胞免疫和炎症方面ADDINNE.Ref.{A021C8D0-80C8-42A9-AA20-437D1FB03F10}[40]。PKCζ-kn阻止NFκB对这些因子的刺激，显示PKCζ在TNF-α、IL-1信号转导中参与NFκB的活化ADDINNE.Ref.{6B44A02D-7BAF-45BB-AD19-974F101404ED}[41,42]。而PKCζ对这些因子的相互机制是通过ZIP/P62来实现的ADDINNE.Ref.{EE83B046-D76A-427F-90DC-2B60BFA463E1}[43]，ZIP/P62作为一个连接器将PKCζ连接到这些因子受体复合物表面，从而让这些因子发挥它们的相应的作用。PKCζ还可以通过构象改变导致NFκB的活化。另外，Par4（凋亡前体蛋白前列腺雄激素敏感因子-4）作为一个可以结合aPKC所有亚型的分子，抑制aPKC的活性ADDINNE.Ref.{3AD18E77-7E8F-48FC-BB1C-24FAD3B883CB}[44]。研究表明，Par4参与到细胞凋亡中ADDINNE.Ref.{B75E30B8-8DC6-48BE-BEDE-903953917AFC}[45]，而且，Par4的过度表达抑制NFκB的激活从而促进细胞的凋亡ADDINNE.Ref.{3814C1AD-82C4-4EA0-873C-3124D3A991EA}[46]，由此可见，Par-4/PKCz/NF-kB轴是控制肿瘤的发生发展的关键因素。总之，aPKC把信号从TNF-a受体，IL-1，NGF转到NFκB的激活位点，它们参与到一系列的信号通道中，从受体复合物到转录因子激活后目的基因的表达ADDINNE.Ref.{2FF8C137-2A7B-441A-AA80-A41B14C8EDB5}[47]。3、P70S6激酶信号及级联反应P70核糖体S6蛋白激酶（P70S6K），在有丝分裂素作用下被磷酸化和激活。对编码核糖体蛋白和翻译延长因子的一整套mRNAs的翻译进行调节。研究表明，PKCλ/ι与P70S6K有直接的关系，在活细胞，PKCλ/ι的显性失活抑制P70S6K血清诱导的活性ADDINNE.Ref.{26BB7000-4874-4F26-B318-EC286427E708}[48]。PKCζ-kn拮抗由EGF、PDK1、PI3K对P70S6K的激活。在生长因子不存在的情况下，体内P70S6K与PDK1、PKCζ有关联，P70S6K是AGC激酶中的一个成员，在激活回路的苏氨酸-229和疏水端苏氨酸-389分别被磷酸化而激活。有活性的PKCζ协调增强这些残基的磷酸化，从而诱导P70S6K的活化时间的延长ADDINNE.Ref.{B6FD444B-42AF-4663-9EFF-6DC083E780EE}[49]。因此aPKCs对P70S6K的活化发挥了重要的作用，但是在活性的PKCζ作用下，仅仅增强苏氨酸-389残基的磷酸化，不足以完全激活P70S6KADDINNE.Ref.{DC79630B-D153-4357-891E-FB26866CAF08}[49]，它需要与多种信号分子如PKB一起作用才可以完全活化P70S6K。4、细胞极性细胞极性是所有正常细胞所拥有的一种基本特性，觉得细胞形态的胞质分子的不对称分布，细胞极性的建立是组织发育至关重要的一步，细胞极性的丧失可导致肿瘤的发生。研究表明PAR-3、PAR-6、PKCζ或PKCλ形成三元复合物对细胞极性的建立非常重要ADDINNE.Ref.{C25CA642-BA95-4920-88A1-9461CBC82C29}[50,51]，它们控制细胞间紧密连接的形成。而PKCζ-kn与PKCλ-kn扰乱ZO-1的定位ADDINNE.Ref.{FEEF6A57-4360-4D2F-B100-A28BAE41E9FF}[52]（ZO-1是紧密连接的成分），更为重要的是，PKCζ中的PB1结构中的Asp残基对紧密连接结构完整性是关键性的，除了内皮细胞外，PKCζ还控制迁移中的星形细胞的极性。三元复合体PAR-3/ASIP-PAR6-aPKC在其他类型细胞的极化中起到了基础作用。在神经细胞中，FEZ1对轴突发育的延长是很重要的，在一定的条件下，FEZ1和PKCζ共同刺激树突的延长ADDINNE.Ref.{27AD357F-C72C-4CD3-85D8-CB25A3A41548}[53]，但是FEZ1单独存在时不能产生这种作用。FEZ1被PKCζ磷酸化后从细胞膜转移到细胞质里ADDINNE.Ref.{574C7826-ED3E-4332-886E-9B59905CCF4C}[53]。PSD-ZIP70，位于突触后密度和树突棘中，与FEZ1有很大的同源性ADDINNE.Ref.{9CAE4CE2-539F-47E2-92C3-11951A794145}[54]。PKCζ与FEZ1/PSD-ZIP70在神经突触的延长及突触后结构的维持中发挥了重要作用，而且，肿瘤抑制基因8p22，在食道癌，前列腺癌，乳腺癌中编码FEZ1ADDINNE.Ref.{D65E9330-5C66-4AC3-8CF1-A879CB347782}[55]，在内皮细胞中FEZ1与微观