荧光分析法课件

24十二月202347-1荧光分析法

Fluorometry

第一节基本原理

第二节定量分析方法

第三节荧光光度计与其他荧光技术24十二月202353-2

概述：光致发光：是物质吸收辐射能产生的激发态电子以发射辐射光的形式回迁至基态时所产生的发光现象。常见的光致发光是荧光和磷光。24十二月202353-3.

荧光：物质从激发态的最低振动能级返回至基态时所发射出的光称为荧光。荧光分析法：根据物质产生的荧光光谱进行定性和定量分析的方法。

荧光分析的种类：分子荧光、原子荧光紫外可见-荧光、红外荧光、X射线荧光荧光分析特点：灵敏度高、选择性好紫外可见检出限10-7；荧光可达10-10/-1224十二月202353-4一、分子荧光（一）分子荧光的产生（二）荧光激发光谱和荧光发射光谱二、荧光与分子结构（一）荧光寿命和荧光效率（二）有机物分子结构与荧光的关系（三）荧光试剂三、影响荧光强度的外部因素第一节荧光分析法的基本原理24十二月202353-5（一）分子荧光的产生1、分子的电子能级与激发过程电子能级的多重性：M=2S+1电子的自旋量子数：s=±½轨道的总自旋量子数：S=∑si=0，1一、分子荧光24十二月202353-6分子电子能级的多重性示意图S*1S0T*1ππ*基态：S=0，M=2S+1=1激发态：S=0，M=2S+1=1S=1，M=2S+1=324十二月202353-7荧光：激发单线态最低振动能级回迁至基态磷光：激发三线态最低振动能级回迁至基态2、荧光与磷光的产生荧光与磷光的发生包括两个过程：（1）电子能级的激发；（2）电子能级回迁——去活化系间跨越去活化主要过程24十二月202353-9（1）振动弛豫（VibrationalRelaxation,VR）处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，电子从高振动能层失活至同一电子能级内低振动能层的过程，称为振动弛豫。（2）内转换（InternalConversion，IC）较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动偶合产生无辐射回迁。去活化主要过程：六个24十二月202353-10（3）外转换（ExternalConversion，EC）受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。常发生在第一激发单重态或激发三重态的最低振动能级向基态转换的过程中。24十二月202353-11（4）系间跨跃（IntersystemConversion）系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，即处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。为无辐射跃迁，重原子或溶液中存在氧分子等顺磁性物质时容易发生。结果：荧光减弱24十二月202353-12（5）荧光发射激发态分子经振动驰豫回到第一电子激发态S1*的最低振动能级，然后在很短时间（10－9～10－7s）再跃迁回基态S0的任一振动能级时所产生的光子辐射称为荧光。因振动驰豫损失能量，发射荧光的波长总是大于紫外激发光的波长。24十二月202353-13（6）磷光发射经系间跨跃从单重激发态跃迁到三重激发态高能层，再经振动弛豫回到三重激发态最低振动能层，最后在10－4～10s内跃迁回基态产生的辐射。24十二月202353-14去活化过程的归纳总结24十二月202353-15（二）荧光激发光谱和荧光发射光谱任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱（荧光光谱）。1、荧光激发光谱（Excitationspectrum）改变激发波长，测量一定波长的发射荧光的强度变化，记录荧光强度F与激发波长λex的关系曲线，即为荧光激发光谱。主要应用：①定性鉴别荧光物质；②为荧光发射光谱选择最适宜激发波长.24十二月202353-16Emissionspectrum荧光光谱fluorescencespectrum固定激发光的波长和强度，记录发射荧光的强度F与荧光波长λem的关系曲线，即为荧光光谱。主要用途：定性定量2、荧光发射光谱24十二月202353-17荧光波长发生Stokes位移：在溶液荧光光谱中，荧光发射波长总是大于激发光波长.（振动弛豫等失活所致）形状：只有一个发射带，与激发波长无关。

（因均为一定激发光下S1*→基态回迁）与激发光谱镜像对称因激发荧光的能级跃迁与发射荧光的能级回迁其能级分布状态和跃迁概率相似，仅能量不同而已。3、发射光谱的特征24十二月202353-18

ex=290nm(MAX)固定

em=620nm(MAX)固定

ex=290nm(MAX)

em=620nm(MAX)S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→31

→21

→1激发光谱发射光谱与发射光谱相同条件下的磷光光谱24十二月202353-202.三维荧光光谱IF

∝f(λex

、λem)蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长24十二月202353-21IF

∝f(λex

、λem)蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长24十二月202353-22二、荧光与分子结构（一）荧光寿命和荧光效率1、荧光寿命去除激发光源后，分子荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，τf.荧光寿命由指数衰减定律求出：以lnF0/Ft对t作图，直线斜率即为1/τf24十二月202353-23τf

与吸光系数的关系为：

τf≈10－5/εmax

（s）εmax

为103～105；τf为10－8～10－10秒荧光寿命的特征性与实际意义：甄别不同荧光组分，可进行荧光物质的混合物分析.24十二月202353-24

f=0～1。与去活化各种过程的速率常数有关：凡使发射荧光的速率常数kF

增加、使其它去活化速率常数ki降低的因素均可增加荧光量子产率。kF通常由分子结构决定，而其它参数则由化学环境和结构共同决定。24十二月202353-25（二）有机物分子结构与荧光的关系分子必须具有吸收一定频率紫外光的特定结构；物质吸收特征频率的辐射后，必须具有较高的荧光效率。1、产生荧光的条件24十二月202353-262、分子结构对荧光效率的影响（1）长共轭结构：共轭度越大，荧光效率越大，荧光越强，荧光光谱红移。（与UV光谱规律类似）24十二月202353-27分子刚性（Rigidity）和平面性越大，分子振动越少，系间跨越和碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高，荧光光谱红移。

（2）刚性平面结构：24十二月202353-28分析并解释下列事实：1-二甲胺基萘-4-磺酸盐

f0.481-二甲胺基萘-5-磺酸盐

f

0.531-二甲胺基萘-7-磺酸盐

f0.751-二甲胺基萘-8-磺酸盐

f

0.0324十二月202353-29

给电子基增强荧光：p–π共轭，如—OH、—OR、—NH2、—CN、—NR2等；化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相对荧光强度1018202020（3）苯环上的取代基：24十二月202353-30吸电子取代基：减弱荧光不产生p-π共轭，降低共轭。—COOH、—C=O、—NO2、—NO、—X等；卤素X取代基随原子序数增加荧光渐弱、磷光渐强，该现象称重原子效应。与π键作用较小的取代基：影响不明显—SO3H、—NH3+无荧光弱荧光24十二月202353-31指与弱荧光物质作用得到强荧光物质的化合物。常用荧光试剂：荧光胺：用于脂肪或芳香伯胺邻苯二甲醛：用于伯胺、氨基酸丹酰氯：伯、仲胺，酚基生物碱测定无机离子的荧光试剂：与无机离子形成共轭结构的荧光配合物（三）荧光试剂24十二月202353-32三、影响荧光强度的外部因素1、温度：影响显著温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加，粘度或“刚性”降低）。2、溶剂：形状、强度均有差别

①一般，极性增大，荧光强度增加并红移②溶剂粘度降低，荧光强度减弱。（温度与此也有关）③因溶剂而形成氢键、电离等作用而改变荧光物质结构会使荧光波长和强度改变。24十二月202353-33在不同pH值时，具酸或碱性基团的有机物结构可能发生变化；无机荧光物质，影响其稳定性。具荧光性的金属有机配合物也受pH的影响3、pH值：24十二月202353-34指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。熄灭剂：卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基羧基化合物等。荧光熄灭的形式：碰撞猝灭；转化为无荧光物质；转入三重态的熄灭，引入溴、碘、氧；电子转移猝灭；浓度较大产生自熄灭。荧光熄灭法:

利用加入熄灭剂后，其荧光强度的减少与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。4、荧光熄灭与熄灭剂24十二月202353-35瑞利光：与物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换只改变方向的散射光。拉曼光：与物质分子发生非弹性碰撞，既有能量交换又改变方向的散射光。干扰及消除：散射光尤其是比入射光波长更长的拉曼光干扰较大。消除方法：选择适当的激发波长避开拉曼光。常见溶剂拉曼光如表11-25、散射光的影响24十二月202353-37一、荧光强度与物质浓度的关系二、定量分析方法三、荧光分析条件的选择第二节荧光定量分析方法24十二月202353-38一、荧光强度与物质浓度的关系1、荧光的检测：检测器与激发光垂直※注意：该公式的近似处理条件Ecl≤0.052、荧光强度和物质浓度的关系：24十二月202353-39荧光分析法比UV分析法更加灵敏荧光分析法在很弱的背景上直接测定荧光强度，其灵敏度取决于检测器的灵敏度，测定溶液的浓度更稀；紫外可见分析法通过测定入射光和透过光的光强比值，浓度很低时检测器很难检测到微小的光强差，信号放大而比值不变，灵敏度仍不能提高。24十二月202353-401、校正曲线法：2、比例关系法：当校正曲线通过原点时，可选择其线性范围，用比例法进行测定。空白不能调零：

(Fs–F0)︰

(F

x-F0)=Cs:Cx

求Cx

F0为空白溶液的荧光强度。3、联立方程式法:用于多组分混合样品含量测定，同UV。二、定量分析方法24十二月202353-41三、荧光分析条件的选择（1）样品浓度的选择稀浓度，10-5μg/ml～100μg/ml吸光度A>0.05时，将向浓度轴偏离。（2）激发光波长和荧光波长的选择若无散射光干扰，一般选最大激发波长为激发光最大荧光波长为荧光的测定波长，测定的灵敏度最高。Fc24十二月202353-42（3）散射光干扰及消除干扰的消除改变激发光的波长；更换溶剂；采用适当的复合滤光片或调整狭缝宽度以减弱散射光。Fc24十二月202353-43第三节荧光分光光度计和其他荧光技术1575年，西班牙医生N.Monardes发现。1852年，SirGeorgeStokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。1867年，首次用于分析测定。1928年，Jette和West制备首台光电荧光计1952年，商品荧光分光光度计出现。24十二月202353-44一、荧光分光光度计I0ItF氙灯、高压汞灯(或激光）200-800nm光电倍增管石英检测器与光路相互垂直24十二月202353-45仪器的校正灵敏度校正：1μg/mL硫酸奎宁对照品溶液。波长校正：激发光谱和荧光光谱校正：24十二月202353-46

（1）激发荧光分析：单色性好、选择性好、灵敏度高。

（2）时间分辨荧光分析：脉冲荧光作为光源，据不同物质荧光寿命不同进行分离。（3）同步荧光分析：利用同步荧光峰峰高与物质浓度的正比关系测定样品浓度。

（4）胶束增敏荧光分析：用胶束对荧光物质有增容、增敏和增稳的作用测定，提高了荧光分析法的灵敏度和稳定性。二、荧光分析新技术24十二月202353-47三、荧光分析的应用1.无机化合物在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。直接荧光测定法荧光熄灭法：测定某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。