脂多糖诱导小鼠巨噬细胞系raw2647细胞活化凋亡

脂多糖诱导小鼠巨噬细胞系raw2647细胞活化凋亡

脂肪子（lps）是革兰氏阴性细菌伤口的主要成分，也是其起源的主要基本因素。LPS是诱导单核/巨噬细胞活化、成熟的主要物质,可通过刺激单核/巨噬细胞产生并释放大量的一氧化氮(NO)、IL-1β以及肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等炎症因子参与机体急性期应答,引起机体炎性损伤[1~5]。单核/巨噬细胞介导的炎症反应不是无限制的进行,通过机体自我调控可以终止炎性反应,但其确切机理尚不清楚。研究发现,LPS短时间刺激可以活化小鼠巨噬细胞分泌NO及IL-1β,而过量的NO又是细胞凋亡的诱导因子。因此推测作为炎性反应的启动因素,LPS有可能通过诱导单核/巨噬细胞产生过量的NO,而诱导其活化凋亡,进而终止其介导的炎症反应。本文观察了LPS长时间刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞后,对其增殖及凋亡的影响,现将结果报道如下。1.材料和方法1.1细胞RAW264.7细胞来源于小鼠巨噬细胞系,由上海细胞所提供。1.2染液和试剂盒LPS购自Sigma公司;RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司;碘化丙啶(PI)染液购自北京鼎国生物技术发展公司;PI-AnnexinV双染试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;NO检测试剂盒购自南京建成生物公司;流式细胞仪购自BD公司。1.3fcs、100u/ml激素的rpmi1340培养模式RAW264.7细胞采用含10%灭活胎牛血清(FCS)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液,在37℃,5%CO2孵箱中培养,每3d传代1次。1.4细胞培养及复孔将RAW264.7细胞以2×105个/孔接种于96孔细胞培养板中,分别加入含终浓度为0.5、1.0及2.5μg/mlLPS的RPMI1640培养液,培养24h。以未加LPS的RAW264.7细胞作为对照。每组设3复孔。收集各孔中的细胞培养上清,用NO检测试剂盒检测上清中的NO含量,操作按说明书进行。1.5细胞培养与检测将RAW264.7细胞以3×105个/孔接种于12孔细胞培养板中,分别加入含1.0μg/mlLPS的RPMI1640培养液,分别于培养3d、6d后收集细胞,采用台盼蓝拒染法在显微镜下计数细胞。1.6细胞周期分析将RAW264.7细胞以3×105个/孔接种于12孔细胞培养板中,加入含1.0μg/mlLPS的RPMI1640培养液,培养6d后,收集细胞,用冰冷PBS洗涤2次,70%冰乙醇固定过夜,加入PI染液(含100μg/mlRNA酶和0.1%Triton-100),避光反应1h,采用流式细胞仪检测细胞周期,Cellquest软件分析结果。另将收集的细胞应用PI-AnnexinV双染试剂盒进行细胞染色,操作按试剂盒说明书进行,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,Cellquest软件分析结果。1.7统计分析应用SPSS10.0软件进行处理,数据用表示,采用t检验进行统计学分析,以P﹤0.05为差异有统计学意义。2.结果2.1两组促进作用比较检测结果表明,不同浓度的LPS对RAW264.7细胞分泌NO的水平均具有明显的促进作用,且具有剂量依赖性,与对照组相比,差异均有统计学意义(t1=4.96,t2=4.89,t3=3.97,P均小于0.01),见图1。表明LPS可促进RAW264.7细胞分泌NO。2.2细胞增殖的影响检测结果表明,LPS刺激RAW264.7细胞3d和6d,细胞的增殖均受到抑制,并具有时间依赖性,与对照组相比,差异均有统计学意义(t3d=3.62,t6d=4.31,P均小于0.01),见图2。表明LPS可抑制RAW264.7细胞增殖。2.3细胞凋亡亚峰检测结果表明,LPS刺激RAW264.7细胞6d后,细胞周期S期的比率为50.47%,明显高于对照组细胞的41.58%(t=2.91,P<0.05),并出现细胞凋亡亚峰,见图3。表明LPS可促使RAW264.7细胞周期S期发生阻滞,且诱导凋亡。2.4两组胞凋亡率比较检测结果表明,LPS刺激RAW264.7细胞6d后,细胞凋亡率为14.09%,而对照组细胞凋亡率仅为7.7%,二者差异具有统计学意义(t=3.71,P﹤0.01),见图4。表明LPS可诱导RAW264.7细胞发生明显凋亡。3.lps的作用机制巨噬细胞是机体防御系统中重要的免疫细胞,在免疫应答中发挥着至关重要的作用。巨噬细胞通过吞噬外来异物或提呈抗原给T细胞,完成清除抗原性异物的免疫防御作用。同时,巨噬细胞也是一种重要的炎症细胞,能够对炎症反应起双重调节作用。巨噬细胞通过分泌NO、IL-1、TNF-α等多种生物活性物质,促进急性期应答,加速对有害物质的清除。但这些生物活性物质也是重要的炎症介质,活化的巨噬细胞如持续性释放过量的炎症介质,可引起机体炎性损伤。因此,机体如何通过自我调节及时终止巨噬细胞活性,具有至关重要的意义。本研究发现,不同剂量的LPS作用于RAW264.7细胞24h,均可活化巨噬细胞,显著提高其NO的释放水平。NO是介导炎症反应的关键因子,在内毒素致机体损伤中起重要作用。LPS通过促使巨噬细胞活化并释放过量NO等炎症分子,进而参与炎症反应,但是,这种活化引起的损伤并不是无止境的。我们发现,随着时间的延长,1.0μg/mlLPS作用3d时,RAW264.7细胞的增殖已明显受到抑制,6d时细胞周期被阻滞在S期,并