中华绒螯蟹生精小管生殖细胞发育不同步研究

中华绒螯蟹生精小管生殖细胞发育不同步研究

近年来，随着人工育苗技术的成熟和育种规模的迅速扩大，对中国的环腺炎进行了全面研究。对其生殖生物学研究主要集中在:生殖系统的形态学和组织结构,雄性生殖系统的组织学,并对雄性生殖细胞进行了分期,针对性早熟开展的卵巢组织切片观察等。而对河蟹精巢发育组织等特征、精巢整体生精小管精子成熟方式和具体的精巢发育周期的划分,迄今未见系统报道。该方面的研究将为河蟹的生殖生物学提供基础资料,为河蟹的人工繁殖和养殖提供基础资料。1材料和方法1.1材料表面河蟹体重10～100g,于2004年3月27日～2004年10月1日,分3次购自白洋淀。1.2巢外部形态解剖河蟹外部形态解剖前,称重河蟹,测量其体长、体宽,并观察体色,前螯绒毛特征情况。精巢外部形态解剖后,观察精巢颜色、位置、形态等特征,称重精巢。生殖腺指数(%)=精巢鲜重(g)/体重(g)×100精巢组织学活体解剖取精巢,用波恩氏液固定,酒精脱水,石蜡包埋,切片厚度为6～7μm,H.E染色,olympus-II显微镜观察摄影。2结果2.1生精小管生长规律精巢1对,玉白色,位于胃的侧后方和心脏两侧之前方。前端左右分离,而在胃的后方以一横桥相连接。组织切片观察,精巢由多数生精小管盘旋而成,外被一层结缔组织膜。生精小管之间是结缔组织的填充物。生精小管横切面大多近圆形,不同发育时期管腔直径和管壁厚度不同。小管一侧为生精上皮,另一侧为管壁上皮,二者均着生于近基膜处,基膜外侧即与结缔组织相联。生精小管中生殖细胞不断增殖形成生殖带。伴随精巢发育,生精上皮不断向管腔内分裂增殖,形成不同发育阶段的生殖带(图1:1)。管壁上皮细胞形状也随精巢发育阶段不同而发生变化:从精原细胞期的长柱状上皮细胞(核呈狭长椭圆形)变成精母细胞期的扁平状(核变扁平),最后变为精子期时的膜状上皮(核短线状或观察不到核)。2.2生殖细胞发育2.2.1不同发育阶段的生精小胞生发区一侧产生精母细胞,不断增殖形成生殖带向管腔推移。生殖带横切面通常为椭圆形或不规则的多边形。在同一个生精小管的横切面上,具有不同发育阶段的生殖细胞(图1:2)。精原细胞最大,位于近基膜处,圆形或椭圆形;初级精母细胞略小于精原细胞,核圆形或椭圆形;次级精母细胞直径与初级精母细胞相近,核圆形;精细胞最小,核圆形。2.2.2输精小管方向组合精巢发育中,前端顶部的生精小管首先成熟,随后沿着精巢外缘向末端输精小管方向推移,成熟的精子进入输精小管,释放后,生精小管内只留下一些空腔(图1:3)。这种成熟方式与生殖细胞在同一生精小管中的发育相似,都是由一侧向另一侧推进成熟。2.3共筑巢发育周期依据河蟹精巢的外部形态、组织结构及生精小管内占优势的生殖细胞等特点,可以将精巢发育周期分为以下几个时期:2.3.1皮细胞的形态河蟹体重约10～20g,体长约20～32mm,体宽约20～36mm。精巢乳白色,精巢重量<5mg(鲜重),约1mm,生殖腺指数<0.02%。生精小管细小密集,外围结缔组织较多(图2:1、2),管壁上皮细胞较大呈柱状,排列不规则,核细长或椭圆形。管腔内精原细胞占绝大部分,细胞核近圆形,在各期细胞中最大,异染色质多团块状,贴核膜分布或随机分布(图2:3、4)。2.3.2精巢发育迅速,生精小管生长迅速河蟹体重约13～40g,体长约28～40mm,体宽约30～45mm,精巢重5～60mg,生殖腺指数0.015%～0.15%。精巢发育迅速,生精小管增多,直径增大,管壁上皮细胞变细长,核变细长,管腔内初级或次级精母细胞占优势,该期生殖带最多,同一生精小管内出现多种生殖带(图2:5)。次级精母细胞<初级精母细胞<精原细胞,染色质聚集于核的四周或一侧,呈空心圆形或弯月状(图2:6),次级精母细胞核浓缩成圆形或不规则形,染色后呈均匀的深蓝紫色(图2:7)。当发育至次级精母细胞后期时,小管直径明显增大,几乎达到精细胞期水平。2.3.3生精小管分布的分布河蟹体重约30～70g,体长约35～65mm,体宽约35～65mm,精巢膨大呈乳白色,重50～300mg,比精母细胞期明显增大,生殖腺指数约为0.15%～0.28%,生精小管直径约为发育初期的2～4倍。管壁上皮细胞形状近膜状,上皮细胞核有的被挤成短线状;有的已不见细胞核,只有膜状上皮。生发区精原细胞生殖带呈弯月状位于生精上皮内侧,生精小管内精细胞占绝大部分。由于染色质进一步浓缩,精细胞核变小,近圆形,直径约为次级精母细胞核的1/2～1/3,染色均匀,核呈蓝紫色,细胞质被染成浅粉色(图2:8)。2.3.4生殖带和脏器河蟹体重约50～100g,精巢特征与精细胞后期相近,膨大呈乳白色,生殖腺指数约为0.2%～0.3%,生精小管直径无明显增大,生发区精原细胞生殖带呈细弯月状或消失(图2:9),管壁上皮细胞成膜状,细胞核呈短线状,且从精原细胞期到精子期细胞有增大的趋势(图2:10)。精子圆形,与精细胞核直径相近或略小,小管内有许多精子镶嵌在管腔内呈暗灰色的营养基质网上,已不见精子期时的浅粉色细胞质(图2:10～12),部分精子成熟后从生精小管内释放形成空腔,一般在生发区对应的另一侧管壁上皮内侧先成熟释放,精子排出的部位形成空腔,小管壁变厚,管壁细胞恢复柱形或不规则多边形。2.3.5精子浓度的影响该期河蟹规格与处于精子期河蟹无明显变化,精巢乳黄色,柔软,由于精子排出,生殖腺指数变小,精巢内结缔组织增多,管壁上皮细胞变厚,生精小管内精子基本排空,管壁内陷,凹凸不平(图2:13)。2.4精巢发育的发育时期河蟹性早熟现象比较普遍,其个体虽小,但精巢发达,生精小管直径粗大,已达到正常发育的成熟河蟹的精巢水平,生殖腺指数明显大于正常成熟河蟹,生殖细胞也已基本发育成熟,达精细胞期甚至精子期,具有不同于正常发育个体的独特外部表现。河蟹精巢通常伴随个体生长逐渐发育,但不同大小的个体之间,精巢发育状况差异极大。少数试验河蟹体重、精巢重均与处于精母细胞期的正常发育个体相似,小管直径略粗于正常发育精母细胞期小管直径,但其生精小管内的生殖细胞绝大多数已达精细胞或精子期(图3:1、2);个别河蟹虽然精巢内占优势的生殖细胞带为精母细胞,但其生殖腺发育指数相对正常发育个体较大,生殖细胞正处于发育过程中,精母细胞最多,已生成较多精细胞。2.5性早熟河蟹生长的形态一只左前螯无绒毛,右前螯有绒毛的特殊河蟹,绒毛没有观察到被人工机械除掉的可能,表现为自身没有生长的迹象。体重24.4g,体长36mm,体宽39mm,体表颜色发白色,并不具备性早熟河蟹的外部特征(图4,图5)。但精巢重182mg,比同等大小的正常发育河蟹发达得多,生殖腺指数达到0.74%,生精小管粗大,内部充满精子,精巢发育达到精子期水平(图6:1,2)。3讨论3.1不同生精小管中生殖细胞的发育精巢由生精小管组成,生殖细胞在同一个和不同生精小管中发育相似。例如,生殖细胞在同一生精小管由生发区开始,不断向内成熟推进,成熟的精子进入输精小管管腔。这与中国对虾(Penaeusorinentalis)、红螯螯虾(Cheraxquadricairnatus)相似。笔者观察到:同一个生精小管内和不同生精小管内生殖细胞的发育都不同步,但同一个生殖带内生殖细胞的发育处于同一时期;这一点与已报道的红螯螯虾精巢生殖细胞的发育特点不同,红螯螯虾精巢内不同生精小管的生殖细胞的发育是不同步的,但同一生精小管内生殖细胞的发育基本相同。精巢整体生精小管生殖细胞的成熟方式:由精巢前端顶部开始,沿精巢外缘向末端输精小管方向推移,最终成熟的精子进入输精小管。无论在生精小管的横向切片上,还是纵向的发育切片上,生殖细胞的发育都是由远离输精小管的一端首先产生,随后逐渐发育成熟,向输精小管方向推进,成熟的精子进入输精小管管腔。这样的组织学结构,使整条生精小管在长度不同的各个部位能同时产生成熟精子,由于生精小管内生殖细胞发育不同步,使精巢能连续不断地产生精子;同时由于精巢整体生精小管生殖细胞的发育由精巢前端顶部开始,逐渐向末端输精小管方向推进成熟,也有利于成熟精子连续的产生。这在生理功能上保证精子持续供给,进而保证河蟹在繁殖季节的多次交配和繁殖。3.2精子细胞期和休止期依据河蟹精巢的外部形态、组织结构及生精小管内占优势的雄性生殖细胞种类和数量,河蟹精巢发育可分为5个时期,即精原细胞期,精母细胞期,精子细胞期,精子期和休止期。研究结果与堵南山的结果一致。由于个体之间发育的差异性,体重、体长、体宽指标并不能充分反应其发育情况,由表1可以看出,它们的发育阶段与3个指标都有交叉,而且用精巢组织切片分期来替代按性腺发育分期更准确。单一的指标例如体重等,并不能完全的反应精巢发育的变化。本研究把体重、体长、体宽、精巢重等因素与精巢发育相结合,可以全面理解河蟹精巢发育阶段,为生殖生物学提供基础资料。3.3精巢内精细胞的发育中华绒螯蟹雌蟹的成熟时间因地理纬度的不同而有所差异。吴萍等研究表明:3月下旬,精巢初步发育,6月份,精巢内已开始有初级精母细胞和次级精母细胞形成,7月份,精巢内已经有精细胞,一般自10月份至翌年3月,精巢内精细胞处于分化后期。叶海辉发现,厦门海区的锯缘青蟹精巢季节周期变化不很明显,而在白洋淀购置的河蟹,由于养殖的原因,精巢发育季节周期变化不明显。3.4精巢重、精巢重生殖腺指数在5个时期都有交叉,这和个体之间差异性有关。精原细胞期到精子期河蟹体重增加,精巢重也增加,但相对而言,精巢发育迅速,生殖腺指数随发育逐渐增大;到了休止期,河蟹体重基本没有增加,而由于精巢中精子的排出,精巢内部形成很多空腔,尽管生精小管管壁变厚,内部结缔组织增多,但是精巢重还是呈下降趋势,生殖腺指数减小。3.5性早熟的结构表征目前,河蟹养殖中1龄蟹性早熟是养殖业较为普遍的问题。关于性早熟原因的分析与探讨,已经有很多报道,但大多集中在外因和外因引起性腺成熟。另外也有过一些内分泌方面的研究,康现江等研究过X器官-