包装材料及食品中纳米颗粒的安全性研究

包装材料及食品中纳米颗粒的安全性研究

纳米科学技术是研究材料在纳米规模上的特性和相互作用，并利用这些特点的科学和技术。广泛应用于原材料、化工、医药、通信、能源等领域。近几年来,纳米科技在包装行业及食品工业中的应用带来了一场产业化的革命,许多新型包装功能材料、具有特殊功能的保健食品和食品开始出现或者被研发。在包装行业,纳米复合材料以其抗菌效果好、机械强度高、阻隔能力强的特点在现代包装市场上取得了快速发展。纳米技术使食品中某些成分的被吸收率成倍增加,营养成分在体内的运输显著加快,食品的保质期大大延长等,解决了食品工业中的一系列难题。根据美国iRAP(InnovativeResearchandProducts)调查公司的市场报告,仅2008年与纳米相关的饮料包装和食品市场份额为41.3亿美元,预期到2014年为73亿美元,年增长率为11.65%。然而有不少研究证实纳米材料对人类健康及生态环境存在着潜在危害,纳米材料开始被视为一种潜在的新型污染物,并受到越来越多研究者的关注。包装材料和食品在日常生活中不可或缺,且消耗量巨大,其中的纳米材料最终将释放到生态环境或进入人体,即使纳米材料没有表现出明显的急性毒性效应,但其长期在生物体内的富集及其对食物链的影响程度等均未知。在对纳米材料安全性没有充分认识的情况下,为了消费者和生态环境的安全,必须控制食品中纳米颗粒的种类、来源及含量,我们迫切需要有效的方法对包装材料和食品中的纳米颗粒进行检测及定量定性分析。分析表征方法的建立有助于纳米包装材料及纳米食品的安全性评估和推动纳米材料环境行为和生态毒理研究的进一步规范。1材料-食品1.1纳米可降解淀粉—包装材料中的纳米材料对于包装材料,近几年来国内外研究最多的是聚合物基纳米复合材料(polymericnanometeredcomposites,PNMC),其工艺是将纳米材料以分子水平(10nm数量级)或超微粒子的形式分散在柔性高分子聚合物中而形成的复合材料。常用的聚合物有聚乙烯(polyethylene,PE)、聚丙烯(polypropylene,PP)、聚酰胺(polyamide,PA)、聚氯乙烯(polyvinylchloride,PVC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethyleneterephthalate,PET)等;常用的纳米材料有金属、金属氧化物、无机物等3大类。目前根据不同的包装需求,已有多种复合材料面市,如纳米Ag/PE类、纳米TiO2/PP类、纳米蒙脱石粉(montmorillonite,MTT)/PA类等,其某些性能如可塑性、稳定性、阻隔性、抗菌性、保鲜性等有大幅度提高,在啤酒、饮料等食品包装工业中也已开始大规模应用,并取得了较好的包装效果。纳米材料的特殊效应使其在包装领域有着极其广阔的应用前景,但也正是其特殊效应使我们不得不面对和重视其生物安全性问题。纳米包装材料的主要威胁来自于包装中纳米材料向食品及环境中的迁移。研究证实,包装材料中的纳米材料有向环境及食品中迁移的动力和趋势。Avella等采用马铃薯淀粉和MMT为原料合成了一种新型的生物可降解淀粉—MMT纳米复合薄膜,然后对其进行了迁移实验。他们将莴苣和菠菜放入复合包装袋中,然后将其置于40℃下进行10d的迁移实验。迁移实验完成后,利用原子吸收光谱(atomicabsorptionspectrometry,AAS)测定了蔬菜中的Si元素的含量。分析结果表明,与未接触复合包装袋的蔬菜相比,Si的含量有大幅增加。由于MMT的主要成份是SiO2,这说明复合包装薄膜中的纳米级MMT向被包装物中发生了明显的迁移。但目前纳米包装材料的潜在健康危害尚待研究。1.2纳米产品的安全性Joseph和Morrison定义在种植、生产、加工、包装过程中,凡利用了纳米技术和纳米工具的均可称为纳米食品。目前,纳米技术在食品领域中的应用主要表现在以下4个方面:新型功能原料的开发、微纳米加工工艺、纳米产品开发及用于食品安全和生物安全的检测方法和仪器。在食品中,除人为添加的工程纳米材料外,食品从原料到加工到包装、贮存整个过程中,均可受到周围环境中纳米材料的污染,如图1所示。有研究表明,环境中的纳米污染物如CeO2、ZnO、C70可被植物如黄瓜、花生、水稻吸收,并在植物中积累。现阶段,在缺乏公众舆论及法律监管的条件下,各种标识及未标识的纳米产品已悄然无声地出现在超市的货架上。表1列举了部分市场可见的纳米包装材料及纳米食品。1.3纳米颗粒生物活性及生物代谢动力学任何一项新的技术,都是一把“双刃剑”,在积极作用的背后存在着无法预料的伦理、道德和健康危害等问题,这是科学技术发展的共识,纳米科技也不例外。在纳米材料广泛应用的同时,不可避免地会在生产、使用过程中释放到周围环境中,对生态系统和环境产生不可预知的影响。由于纳米颗粒较小,可以越过机体的生理屏障。它能穿过生物膜到达细胞、组织及器官,一旦进入循环系统,纳米颗粒便可以到达潜在的敏感靶部位,例如骨髓、淋巴结、脾脏和心脏,从而损害机体。美国著名毒理学家Oberd9rster小组首先证实了纳米颗粒从肺组织向脑组织的迁移,继后人们发现纳米颗粒可以跨越血脑屏障进入脑组织,甚至发现纳米颗粒可造成一定的DNA损伤。表2列出了近年来在包装材料及食品中有应用价值的几种纳米材料的健康危害特性。纳米颗粒的理化特性是决定其生物活性的关键因素。许多参数如:大小、形状、化学活性、结晶度、表面性质(表面积、孔隙、电荷、表面修饰、涂层风化)、聚集状态、生物持久性和剂量水平等决定了纳米颗粒的生物活性和生物代谢动力学,但其作用机制目前仍不很清楚。纳米材料具有怎样的剂量—反应特征?用怎样的测试程序、模型和生物标志物来评价纳米材料在生物体内潜在的毒性效应?评价和预测纳米材料安全性的外推模型是什么等一系列问题一直困扰着纳米材料的安全性评价系统。如Oberd9rster等列举了评价过程中需测量的物理化学参数高达16个,这是与传统毒物分析截然不同的地方,纳米材料的分析是一个“多参数”的分析。然而,尽管使用的评价方法和生物体系很多,但目前国际上尚未形成统一的针对纳米材料生物安全性评价标准。所以,对于包装材料及食品中纳米材料的安全性评估我们仍面临着许多挑战。我们必须对包装材料及食品中纳米颗粒可能的释放、迁移以及这些材料对人类及生态环境健康的危害做出评估,以保证人类及生态环境的可持续发展。纳米材料的安全性问题也已经成为纳米复合包装材料及纳米食品研究和开发的新瓶颈。2纳米材料的表征由于纳米材料的理化性质参数众多,与传统有机小分子,无机化合物和低聚物的检测相比,纳米材料的检测要复杂很多,应用多种分析手段来检测和表征纳米材料成为必然。下面着重介绍几种常用的纳米材料表征方法。2.1纳米颗粒的表征显微技术包括光学显微镜、电子显微镜以及原子力显微镜等,是最直观表征纳米颗粒形貌和尺寸的技术手段,真正做到“眼见为实”。由于纳米颗粒较小,只有高分辨率的显微镜才能对食品及生物样品中的纳米颗粒进行定位。传统光学显微镜因分辨率低,一般无法对纳米材料进行成像分析。但近场扫描光学显微镜(nearfieldscanningmicroscope,NSOM)作为一种扫描探针显微镜的衍生技术,空间分辨率已达到10nm以下,对生物样品无损伤,可在自然和生理条件下研究生物样品。Maynard等用分辨率50~100nm的NSOM对纳米颗粒的团聚情况进行了成像分析。激光扫描共聚焦显微镜(confocallaserscanningmicroscope,CLSM)可利用荧光分析方法对纳米材料本身发光或外接荧光标记物进行成像检测,从而得到样品中纳米材料的分布情况。虽然普通商用激光共聚焦显微镜的检测限约为200nm,但这并不影响其对纳米颗粒及其团聚体的准确定位。Johnston等借助相干反斯托克斯拉曼散射显微镜(coherentantistokesramanscattering,CARS)检测了虹鳟鱼对纳米氧化物的生物可吸收性,从获得的显微镜图片中可直接观察到纳米颗粒在虹鳟鱼鳃片部位的团聚。电子扫描探针显微镜在纳米材料表征中使用最为广泛,其分辨率可达到亚纳米级别。透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)、扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope,SEM)不仅可以对纳米颗粒成像,也可对颗粒的团聚情况、粒度分布、大小、形状等参数进行分析。实际应用过程中,多将电子显微镜与能谱联用,在对材料进行成像的同时也对材料进行元素分析。Bedre等人合成了聚苯胺-氧化钴纳米复合包装材料(polyaniline-Co3O4nanocomposites)并利用SEM、TEM表征了材料的形貌及尺寸大小。Vermogen等人利用TEM对采用单螺杆挤压机和双螺杆挤压机等不同挤压法生产的PP-MMT复合包装薄膜进行了纳米颗粒的形貌和结构表征。结构分析表明,不同挤压法得到的复合薄膜中纳米材料的形貌及尺寸均不同。上海大学陈欣欣等利用萃取、离心等物理方法从口香糖中分离出TiO2纳米添加剂,利用透射电镜与能量散射X-射线光谱仪联用(transmissionelectronmicroscopy-energy-dispersiveX-rayspectroscopy,TEM-EDX)、SEM及纳米粒子跟踪分析(nanoparticletrackinganalysis,NTA)技术对分离提纯的TiO2进行了形貌及粒径表征。分离出的TiO2纳米添加剂的粒径多集中在80~160nm。对于TEM和SEM而言,必须在真空条件下操作,样品必须进行干燥、低温固定或嵌入等前处理,纳米颗粒的真实状态受样品制备过程的影响较大,这严重限制了其在食品及环境检测分析中的应用。环境扫描电子显微镜(environmentalscanningelectronmicroscope,ESEM)和环境透射电子显微镜(environmentaltransmissionelectronmicroscope,ETEM)保留了传统SEM、TEM的优点,取消了对样品环境必须是高真空的限制、能够在一定程度上反映纳米颗粒的真实存在状态,是分析食品及环境介质中纳米颗粒的有效手段,但需要牺牲一定的分辨率。湿法-扫描透射显微镜(wet-scanningtransmissionelectronmicroscope,wet-STEM)可直接对液体样品进行高分辨率成像分析,无需复杂的样品制备过程。Dudkiewicz等详细阐述了电子显微镜如低温显微镜、暗场显微镜、ETEM、ESEM、聚焦离子束电子显微镜、wet-SEM等在食品中纳米材料检测及表征中方面的应用,并介绍了样品的制备方法(干燥、干燥—冷冻、染色等)和测量效果的关系。原子力显微镜(atomicforcemicroscope,AFM)利用的是探针与样品表面间的相互作用力(包括静电、范德华力、摩擦力、表面张力和磁力)成像,既可以观察导体,也可以观察非导体,在常压及全液体环境下都可以良好工作,大大扩展了分析样品的范围。费斐等研究了PVC包装薄膜中增塑剂邻苯二甲酸二异辛酯(diethylhexylphthalate,DEHP)向食品模拟液中的迁移行为,同时利用等离子体增强化学气相沉积(plasmaenhancedchemicalvapordeposition,PECVD)在PVC表面沉积纳米级SiOx和类金刚石(DLC)阻隔层,经过对比发现在优化的条件下,可以实现将DEHP迁移率降低98.7%,这说明纳米阻隔层能有效限制PVC中增塑剂DEHP向食品中迁移。该实验小组利用AFM对食品模拟液浸泡前后阻隔层的形貌进行了表征,如图4所示。2.2流体动力色谱色谱技术是一种用来分离多分散体系中纳米颗粒的方法。常见的尺寸排阻色谱(sizeexclusionchromatography,SEC)、流体动力色谱法(hydrodynamicchromatography,HDC)和高效液相色谱((highperformanceliquidchromatography,)均可用于纳米材料的分离及表征分析。对于包装材料而言,色谱技术主要用于其中纳米材料及小分子的迁移实验研究。将色谱分离技术与质谱等各种分析设备联用,不仅可以实现包装材料迁移实验模拟液、食品、水等样品中纳米材料的分离,还能对分离的纳米材料进行元素及量化分析,是分离科学中的一项突破性进展。SEC又称为凝胶渗透色谱(gelpermeationchromatography,GPC),通常使用溶剂作流动相,多孔填料(如多孔硅胶、多孔玻璃)或多孔交联高分子凝胶作分离介质。当纳米颗粒分散液随载流液通过色谱柱时,大颗粒因为无法进入多空填料或凝胶的小空穴而先于小颗粒被洗脱。这种技术已经应用到量子点、碳纳米管等纳米材料的尺寸表征。SEC的主要缺点是粒径分离范围较窄,可能无法实现原始纳米颗粒及其团聚体的同时分离。流体动力色谱(HDC)多利用无孔刚性固体颗粒来填充其色谱柱。其分离机理可描述为:当流动相从填料颗粒间经过时,由于水动力效应的存在使其流型为层流抛物面型,溶质在这种情况下的分离主要是借助于靠近填料表面的低流速区域所产生的排斥效应,大颗粒由于受到的排斥效应大于小颗粒,更容易远离填料表面而进入高流速区域,而先于小颗粒被洗脱出来。HDC测定的粒径分布交较宽,涵盖了5~1200nm的范围,主要缺点就是峰的分辨率较差。Tiede等将HDC与电感耦合等离子体质谱(inductivelycoupledplasmamassspectrometry,ICP-MS)联用,在TiO2、SiO2、Al2O3、Fe2O3等纳米颗粒的表征中取得了较好的效果。Dekkers等人成功利用HDC-ICP-MS将咖啡伴侣、速溶汤、奶粉等27种食品中纳米级SiO2(E551)抗结剂进行分离,并检测了纳米级SiO2(E551)抗结剂的含量。SiO2纳米颗粒的大小由色谱图中的停留时间确定,颗粒的浓度根据峰面积计算得出。高效液相色谱主要用于有机纳米材料如C60和C70的分离。ChaoWang等人将高效液相色谱与ICP-MS及紫外可见光吸收光谱(ultraviolet-visiblespectroscopy,UV-vis)相结合,对环境水样品中的富勒烯及其转化产物进行了分离与量化分析。同色谱方法类似,场流分级(fieldflowfractionation,FFF)也是一种洗脱技术,不同的是FFF没有固定相,所以被称为“单相色谱”。场流分级分离法结合了色谱和场驱动技术的基本要素,样品组分除随流动相流动外,还受到与分离流道垂直或成某种角度的分离场力作用下向流道管壁一侧移动。不同组分受分离场力作用不同,小颗粒受到场作用力小,处于流道中心附近,流速快;大颗粒受到的场作用力大而向流道侧壁聚集,在柱内停留时间长,后流出,从而实现不同粒径纳米材料的分离。FFF技术可与紫外吸收、ICP-MS、多角度光散射(multi-anglelightscattering,MALS)、动态光散射(dynamiclightscattering,DLS)等其他在线检测设备联用,样品从分离管道的一端注入,另一端收集检测,分离的同时也实现了样品的检测和表征。FFF常用的外场为沉降场(sedimentationfieIdfIowfractionation,SdFFF)、流体场(flowfield-flowfractionation,F4),两者均可用于复杂食品及环境样品中纳米材料的分离。Schmidt等人研究了食品级复合包装材料中纳米级粘土向食品模拟物中的迁移行为,通过非对称流体场场流分级(asymmetricalflowfield-flowfractionation,aF4)、MALS和ICP-MS技术联用,在食品模拟液中检测出粒径在50~800nm的纳米颗粒,并对迁移物进行了定量分析。2.3不同氧指数法制备siox薄膜的表征光谱分析方法是研究纳米颗粒结构和性质的重要手段之一,各种物质的原子内部电子的运动情况不同,所以它们发射光的波长也不同。紫外可见光吸收光谱(UV-vis)是利用物质的分子吸收200~800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。已经有文献报道了不同粒径ZnO及C60胶体的UV-vis吸收光谱,并建立了根据吸收光谱分析其粒径分布的理论模型,这些研究表明纳米胶体吸收峰的位置与粒子尺寸有关,粒径小吸收峰的位置会发生蓝移,粒径大或分布范围宽则吸收红移。另外,纳米颗粒的形貌也会影响表面等离子体共振吸收带的形状。Au纳米棒有一个强的红移峰和一个弱的蓝移峰,且随着纳米棒长径比的增加,对应于长轴的表面等离子体共振峰明显红移。红外光谱是基于基团振动的光谱技术,最常用的是傅里叶变换红外光谱(fouriertransforminfraredspectroscopy,FTIR)。利用FTIR可以对沉积在包装材料表面或掺杂在其中纳米材料进行定性分析。费斐等利用等离子体增强化学气相沉积(PECVD)在PVC表面沉积了纳米级SiOx功能阻隔层,借助FT-IR对不同O2及单体六甲基二硅氧烷(hexamethyldisiloxane,HMDSO)比例条件下沉积在PVC表面的SiOX的元素组成和结构进行了表征。从图5中可以看出,808和1057cm-1附近分别出现了Si-O-Si基团的对称和非对称伸缩振动峰,说明在PVC上制备了SiOx薄膜。通过对红外光谱进行的分峰拟合,探讨了不同氧气与单体比例对SiOx薄膜Si-O-S结构的影响,随着O2比例的增加SiOx网络状结构的成分逐渐增加,而线性(或环状)和笼状结构成分不断减少。这说明了薄膜的结构由线性亚稳态结构逐渐转向网络状SiO2结构。X射线光谱包括X射线吸收光谱(X-rayabsorptionspectroscopy,XAS)、X射线衍射(X-raydiffraction,XRD)、X射线光电子能谱(X-rayphotoelectronspectroscopy,XPS)、X射线荧光(X-rayfluorescence,XRF)。X射线吸收精细结构谱学(X-rayabsorptionfinestructure,XAFS)是20世纪70年代发展起来的同步辐射特有的结构分析方法。它的基本原理是吸收X光的原子激发出的光电子与最近邻和次近邻原子发生多重散射,以此来确定吸收原子附近的局域结构(如键长、键角、配位数以及配位原子种类等)和电子结构(如金属原子的价态,费米面附近的态密度等)。XAFS分为X射线近边吸收(X-rayabsorptionnearedgestructure,XANES)和扩展X射线吸收(extendedX-rayabsorptionfinestructure,EX-AFS)。XANES对吸收原子周围的元素种类和空间几何结构有着很高的灵敏度,可以研究复杂食品基质中任一种元素周围的几何配位环境和电子结构,因而能反映出包装材料及食品中纳米添加剂元素化学形态的信息,及其在生产、贮存过程中可能的价态变化。XRD可依据X射线对不同晶体产生不同的衍射效应来鉴定物相及其含量,是研究晶体结构的重要手段。其测定内容主要包括各组分的结晶状态、晶相、晶体结构及各元素在晶体中的价态等。常见的纳米颗粒如Al2O3、SiO2、TiO2等均具有多种晶型,纳米颗粒晶相的确定是进行实际应用及安全性研究的重要前提。Vaia1等利用小角X射线散射(smallangleX-rayscattering,SAXS)技术对聚合物中MMT的相变过程及其对聚合物基质相变的影响进行了详细阐述,通过调整MMT相变可以改变复合薄膜的物理性能。X射线能量色散光谱(energydispersiveX-rayspectroscopy,EDS)借助于分析试样发出的元素特征、X射线的波长和强度,实现对纳米材料元素成分及相对含量的分析。通常配套于SEM等显微镜技术中进行扫描微区的元素分析。Gatti等研究了纳米、亚微米材料对面包的污染,利用STEM-EDS联用技术对污染物进行了成像及元素分析,从中发现了对人体有害的重金属钨、钽和钴(见图6)。动态光散射(DLS)可用来测量纳米颗粒在溶液或悬浮液中的水合粒径大小及粒度分布,测量的粒径范围为2~3000nm。其测量原理是基于纳米颗粒在溶液中的布朗运动,这种无规则的运动使得散射光强相对于某一平均值产生随机涨落,并且这种涨落与颗粒的粒径有关,颗粒越小,涨落越快,通过计算这种涨落变化的时域自相关函数,就可以得到影响这种变化的颗粒粒径信息。因此,DLS也称光子相关光谱(photoncorrelationspectroscopy,PCS)。由于DLS测量的是粒径的平均值,强度分析可能会偏置于样本中的大颗粒或污染颗粒,从而影响检测结果的准确性。一般的动态光散射仪还可以用来分析颗粒的Zeta电位,Zeta电位是表征纳米颗粒分散体系稳定性的重要指标,Zeta电位的绝对值越高,体系的稳定性就越好。纳米粒子跟踪分析(NTA)同样是基于粒子布朗运动产生的光散射原理实现的。NTA可以对每个颗粒单独观测,将每一个进行布朗运动在液体中扩散的颗粒的直径计算出来,测量的粒径范围在10~1000nm。NTA的优点为:测量前无需提供溶液的折射率;对颗粒单独分析以获得高精度的粒径分布,强度分析不会偏置于大颗粒,从而弥补了DLS设备的缺陷;可获得实时的动态纳米颗粒影像。由于DLS和NTA技术仅可以用来对液体中的纳米材料进行表征,所以实际操作中必须将纳米颗粒从包装材料和食品中提取出来才可进行检测,这极大地限制了两者的使用范围。2.4分析测试方法质谱法是一种与光谱并列的谱学方法,通过将纳米颗粒转化为运动的气态离子,并通过对其质荷比的分析而实现样品定性和定量。质谱有很多种类,根据电离方法可大体分为电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)、电喷雾质谱(electronicsprayion-massspectrometry,ESI-MS)等。目前应用较为普遍的是ICP-MS,其检测限可达ppt级,已广泛应用于复杂的生物样品和环境样品中纳米材料的元素测定及准确定量。在生物学上,利用ICP-MS可实现纳米材料在生物体内的代谢动力学研究。国家纳米科学中心陈春英课题组将ICP-MS和XANES等其他表征手段相结合研究了Au、TiO2、ZnO、Cu等纳米材料在生物体内的吸收、分布、代谢、排泄和元素形态转化,建立了生物体内纳米材料代谢动力学研究的系统集