纯钛种植体表面经微弧氧化工艺处理后的成骨效能

纯钛种植体表面经微弧氧化工艺处理后的成骨效能

自半个世纪以来，纯钛材料在植物的临床应用中发挥着良好的作用，具有良好的骨生物适应性、耐腐蚀性和易于加工的财务费用。它可以与骨组织形成一定程度的骨结合（osetintigra），并以各种优点（如黑面包面动物植物）形成口腔栽培。主要以基本材料为基础。但在不断的使用研究中发现,纯钛种植体的表面生物活性差,缺乏骨诱导作用,与周围骨组织难以形成强有力的化学性结合而成为口腔医学种植领域中一直未能解决的难题之一。同时在人体生理环境中及负载条件下纯钛种植体的耐磨性较差,并且容易向周围组织内释放金属离子形成比较明显的金属腐蚀圈,这些缺点都严重的影响了钛种植体的临床成功率,并明显制约了种植技术的广泛开展。持续性的研究显示:由于与周围组织发生金属反应的相互作用区主要在种植体表面,因此如何通过种植体表面改性的方法,改善钛及其钛合金的耐磨性、耐腐蚀性,并着重增大增强纯钛种植体表面的生物活性,进而提高种植体的骨结合强度,缩短愈合时间则成为口腔种植学领域里研究的热点课题。因而最近人们开始在种植体研究中尝试开展新的表面改性方法,使钛及钛合金植入材料表面具备有良好的生物活性,从而能得以增强纯钛种植体的早期或即刻承重力,最终达到牢固的骨愈合。微弧氧化(Micro-arcOxidation,MAO)全称等离子体微弧氧化,它是一种直接在有色金属表面原位生成陶瓷层的新技术。将AL、Mg、Ti等金属样品放入电解质溶液中,通电后,金属表面立即生成很薄的一层金属氧化物绝缘膜。在微弧氧化过程中溶液中电解质离子不仅起导电作用,还要参与微弧放电区的物理化学反应,进入氧化膜层中。因此可以利用这一现象可以将Ca、P元素引入到钛氧化膜中。其氧化产物是一种多孔状,与基质结合牢固、具有陶瓷特性的氧化膜。因此利用微弧氧化技术处理纯钛种植体后可以得到富含钙磷元素,表面疏松多孔,并逐渐向与基体结合牢固的致密氧化层过渡,具有一定梯度分布的复合二氧化钛膜表面。其物理、化学特性与微弧氧化处理时电参量的选择、电解液的配方以及样品自身的特性有关,经微弧氧化工艺处理的种植体与原材料基质本身相比,其耐磨、耐腐蚀、电绝缘等性能都得到明显改善。本实验利用微弧氧化技术工艺构建出一种新的粗化、活化的纯钛基体二氧化钛膜表面,并且检测观察其表面性状,进而再采用体内和体外实验检测评定其生物相容性和成骨效能。1材料和方法1.1试验组和方法纯钛组(华南理工大学材料学院提供)为对照组,微弧氧化组(将对照组的纯钛种植体经微弧氧化工艺处理)为试验组,均制备成长为10mm,直径为4mm的圆柱状种植体。1.2先锋vi小瓶消毒两种不同的种植体共36枚,经丙酮超声清洁5min,无水乙醇超声清洁5min,去离子水清洗后,密封包装于洁净的先锋VI小瓶中高压蒸气消毒后备用。1.3分组及命名将9只成年Beagle犬(中山大学动物实验中心提供),雌雄不拘,平均体质量在10～12kg,随机分配到甲、乙、丙3个组(对应取材时间为4、8、12周),每组3只,组内分别编号为1、2、3。每只犬下颌可以植入4颗种植体(左右侧各两颗),每只试验动物左,右两侧分别种入纯钛和微弧氧化两种种植体。1.4骨髓细胞处理采用体积分数为3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,剂量为30mg/kg体质量。实验Beagle犬仰卧位位于手术台,固定头部四肢。术区消毒(以体积分数为0.1%的新洁尔灭行口腔内消毒,面部以体积分数为3%的碘酒,体积分数为75%的酒精消毒),铺巾。严格遵守外科无菌操作技术,沿下颌骨下缘切开皮肤,钝性分离皮下组织肌肉,充分暴露下颌骨。位于左下颌第一磨牙下方球钻定位第一种植位置,(第二位置在第一位置近中1cm处),扩孔钻逐级扩大种植钉孔,钻时以生理盐水持续冷却,以防止骨灼伤。最后完成洞深约10mm,直径约为4mm。钻孔时尽量使钉洞方向保持平行并注意防止颊舌侧穿。严密缝合粘骨膜瓣。术中补液200mL糖盐+先锋Ⅵ1g。术后3日连续每天肌注2g/d,连续一周半流饮食。每天清洗伤口,一周后拆线,改普食。动物圈养于中山大学动物实验中心。分别于4、8、12周氯安酮肌注麻醉动物后用气栓法处死动物,截取下颌骨标本固定于体积分数为4%的多聚甲醛液。手术刀、镊子、组织剪、持针器、止血钳、骨膜剥离器、不锈钢直尺,牙周探针、BLB种植工具、牙科专用微型电机。1.5种植体骨结合力的测定观察术后试验动物的麻醉清醒情况,饮食情况,行动情况。每天清洁伤口一次,观察伤口愈合情况,检查种植区有无感染情况。检查双侧下颌区有无肿大淋巴结。取材后,去除下颌骨上的牙龈及软组织,显露种植体,肉眼观察种植体愈合情况,注意种植体有无松动,脱落。检查周围软组织情况。所有标本均在取材后2h内拍摄X光片(牙科X摄片机,德国),拍摄条件:40kV/100mA、曝光时间0.05s拍摄距离为5cm。分别观察手术后第4周、第8周、第12周种植体与下颌骨骨体的结合情况,种植体周围骨硬度、骨密度情况,特别注意观察有否骨坏死及吸收等现象。取材后24h内完成顶出实验。实验前用金刚砂片切开种植体周围骨组织,修整种植体两端多余骨质,显露种植体两端。使用采用WE-10型万能材料试验机(日本)测种植体骨结合力。将带种植体骨块固定于拉伸机的测力底座,使测力杆方向与拉伸长轴一致,然后用测力夹具夹住测力杆上端,仪器调零后,开始加力,以0.5mm/min速度拉伸,记录种植体被拉出时的最大值,作为骨结合的值。计算各时间点不同处理组的结合力均值,并进行不同处理组结合力的比较。使用SPSS10.00统计软件利用多因素方差分析进行分析比较。将2个月时标本用金刚砂片片切成骨组织带种植钉的骨块横截面。戊二醛固定标本一周后,PBS液中冲洗标本20次。再用PBS液浸泡冲洗后标本24h,按以下方式制样:(1)上行脱水:用体积分数为50%的酒精浸泡标本10min、体积分数为70%酒精浸泡标本10min,体积分数为90%酒精浸泡标本10min、体积分数为100%的丙酮(加无水CaCl2)30min;(2)置换:醋酸异戊酯(加无水CaCl2)20min;(3)喷金:取观察面向上,慢速喷金。通过日立S-520扫描电镜观察种植体-骨结合面情况。1.5.6组织学观察在种植后4周、8周、12周各处死动物三只,获取带种植体的骨组织标本,用体积分数为10%的福尔马林固定。将标本用金刚砂片分切后,各组共6份标本,其中一分标本做大体组织横截面观察(4周份标本)、电镜扫描(8周份标本)或者不脱钙硬组织切片(12周份标本)。不脱钙硬组织切片(12周标本):将带种植体骨块用丙酮脱水(更换三次丙酮,12h一次),树脂包埋,用硬组织锯氏切片机(Leitz-1600德国)制作带种植体的切片,切成1mm厚的4份标本,然后逐级研磨成厚度150μm的切片,采用甲苯安蓝染色,观察种植体-骨结合界面。显微镜观察种植体骨界面处骨质形成情况。采用APOLLODN-35OO计算机辅助图象处理系统对组织切片作定量组织学测量计算骨性结合率(OR)。脱钙骨组织切片:每个时间点每种材料其余三份标本作顶出实验后,将骨组织用体积分数为14%硝酸脱钙后,依次用100%、90%、80%、70%酒精下行梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。用Leica自动切片机切取厚6μm的切片。HE染色。显微镜观(Axiovision4.0德国)观察种植体骨界面新骨形成情况,并用Axioplan2Imaging软件拍摄镜下切片。2结果2.1半流质、行动能力9只犬均术后1h左右麻醉清醒,即日即可进食半流质,行动良好,无其他不适。每天清洗伤口一次,观察伤口愈合良好,种植区均未见明显感染,未有种植体脱落,双侧颌下区未扪及肿大淋巴结。2.2覆盖钉的选择所有种植钉(36枚)均未发生松动,脱落,存留完好,种植体与骨结合良好部分种植钉顶部被骨皮质覆盖。种植体周围软组织未见感染、化脓、坏死(见图1)。2.3骨与种植体的连接可以看到标本(4周)时,骨-种植体之间结合良好,图2中可以看到种植体靠近骨髓腔的一面有新骨形成,图3可以看到骨与种植体直接连接,没有看到明显的间隙存在。2.4种植体密度和密度所有标本均在取材后2h内拍摄X光片,4周时,可见纯钛种植体周围仍可见明显的低密度区,尤其以上部明显,两侧缘与骨结合处也可见密度明显低于正常区域。微弧氧化组可见种植钉周围骨质密度稍低于正常骨密度,顶端见明显低密度暗影。8周时,可见纯钛组种植体顶端仍见低密度暗影,但较4周时密度增高,两侧缘未见明显低密度暗影。微弧氧化组种植体周围均未见明显低密度暗影。12周时,两组种植体周围均未见明显低密度暗影,但是纯钛组种植体周围密度要稍低于微弧氧化组。微弧氧化组种植体周围骨密度已经接近正常骨组织,骨密度均匀,骨小梁排列整齐。2.5小鼠骨结合力、微弧氧化组骨结合力明显低于纯钛组两种种植体表面骨结合强度存在明显差异,总的趋势是微弧氧化组骨结合力明显强于纯钛组。两种种植体的骨结合力有明显的统计学差异,统计结果见表1。2.6组织结合和表面涂层从扫描电镜照片可以看到微弧氧化组形成比较厚的新骨,并且新骨与种植体和原来成熟的骨组织结合非常紧密,基本看不到间隙。同时也可以看到表面涂层与钛基体没有明显的界限。纯钛种植体表面也可以看见新骨形成,但是相比较前两组新骨形成的宽度明显窄,新骨由于强度不够,故制备扫面横截面时,种植体有松动,在镜下可以看到比较明显的裂隙。2.7界面性质成骨细胞4周时(图5A、B),可见纯钛组界面主要为结缔组织和类骨质成分为主,只有少量新骨形成,靠近种植体部分可见大量的间充质细胞聚集成膜状,在新骨周围可见大量单层排列的椭圆形成骨细胞,周围是大量的类骨质,其中可见骨源细胞包埋于类骨质中。而微弧氧化组可见较多骨小梁形成,新生的骨小梁边缘可见大量单层排列的低柱状成骨细胞,骨小梁之间是类骨质和结缔组织,还有很多新生的毛细血管,靠近种植体的边缘是由间充质细胞组成的膜。8周时(图5C、D),纯钛组界面处可见少量的骨小梁,以编织骨为主,也可见大量的类骨质和结缔组织共存,大量成骨细胞排列于新生骨周围,成骨活跃,但是所形成的骨仍不成熟。微弧氧化组8周时,界面大部分由骨组织构成,部分骨小梁已逐渐融合成不规则的密质骨,不过未见成熟的哈佛氏系统,提示新骨并不成熟。新骨周围仍可见大量的单层排列成骨细胞,靠近种植体边缘可见结缔组织形成的膜。12周(图5E、F):纯钛组可见新生骨较前明显成熟,新生的骨小梁融合成不规则密质骨。未见新形成的密质骨中有明显的骨单位(哈佛氏系统)形成。不过仍可见大量类骨质和结缔组织位于界面边缘,内有大量成骨细胞。微弧氧化组12周时,大部分新生骨组织融合在一起形成密质骨,骨组织比较成熟,可见多个成熟哈佛氏系统,界面处的膜已经逐渐吸收。可见部分新骨在界面外突成不规则状,可能是长入种植体表面的孔洞里所致。各个时间段各组组织学检查切片如图6～8。2.8微弧氧化加“骨”12周时可以看见,纯钛与种植体之间仍有明显的软组织成分存在,新骨形成相对不如微弧氧化组成熟。微弧氧化组新形成的骨突入种植体凹凸不平的表面,形成犬牙交错的骨结合形状。三个月时不脱钙组织学结果(图5G、H)。3微弧氧化对成骨细胞的控制作用种植体与骨形成良好的骨结合需要具备以下几个条件:(1)增加骨结合力(率);(2)促进骨的快速沉积,缩短愈合时间;(3)增加植入初期的稳定性。以上三个目的实现与种植体表面四个因素有关:(1)表面成分(2)表面能(3)表面形貌(4)粗糙度。通过种植体表面改性的方法,改善钛及其钛合金的耐磨性、耐腐蚀性,并着重增大增强纯钛种植体表面的生物活性,进而提高种植体的骨结合强度,缩短愈合时间已成为口腔种植学领域里研究的热点课题。经微弧氧化处理后的纯钛表面二氧化钛膜含有很高的钙磷成分,而且钙磷分布由表面较高逐渐向基体减低形成一个梯度分布。富含钙磷的表面可以诱导钙磷盐的沉积,可以加速骨化和骨成熟。体外矿化实验已经证明可以促进钙磷盐的沉积在SBF浸泡后形成的仿生矿化层主要成分是类似自然骨组织的低结晶度的CHA(表面碳酸羟基磷灰石,Carbonate-HychroxyApatite),所以也可以很好的在体内诱导钙磷盐沉积,并促进骨组织早期形成。同时有学者研究证明皮下埋植实验也一样可以诱导钙磷盐的沉积:4周时,沉积层已经初步形成,之后经过不断的改建和钙化,8周时可以形成稳定的类似骨组织成分的沉积层。经观察,经微弧氧化处理后的种植体表面最终生成的微弧氧化膜表面粗糙不平,呈现大小不等的类似火山喷发后的残留形貌。每个大颗粒中间残留一个几微米大小的放电气孔,如同火山口状。颗粒熔化后连在一起,在大颗粒表面能观察到膜熔化过的痕迹。膜表面还有许多直径小于1μm的气孔。氧化膜与基体结合紧密,二者之间没有明显界面。氧化膜表层和内部致密程度有所区别,表层氧化膜明显可见许多胞状孔穴缺陷,疏松多孔,在靠近钛基体的厚约10μm的氧化膜部分孔洞减少,较表层致密,并嵌入基底内部,与基底结合呈犬牙交错状。这种表面粗糙多孔,并且具有二级孔洞的结构,不仅植入骨组织后可以与其形成镶嵌状的物理性结合,有利于新骨长入孔洞内,可以增加种植体的早期稳