多囊卵巢综合征大鼠抗苗勒管素表达与胰岛素抵抗的相关性研究

多囊卵巢综合征大鼠抗苗勒管素表达与胰岛素抵抗的相关性研究

多囊卵巢综合征（p-co）是一种发育障碍和高度异质性的发育障碍。其发病机制尚不清楚。高胰岛素血症及高雄激素血症是PCOS患者主要的内分泌紊乱特征,是引起PCOS患者局部病理变化的病理生理基础;AMH作为卵巢局部一种重要的调节因子,在PCOS的发病中的相关作用近年来成为研究热点。目前的研究认为,高雄激素的发生可能与AMH有一定的相关性［1］,也有学者认为PCOS患者雄激素水平的升高可能与多囊卵巢组织自身存在IR有关［2］。目前对于卵泡生长发育过程中AMH和IR两者间是否存在相互作用尚未有深入的研究报道。因而,我们通过制作PCOS大鼠模型,探讨卵巢局部及单卵泡AMH表达与IR之间的相关性,以期对PCOS发病机理及临床异质性的分子机制的探讨提供一些实验依据。1amh、ir表达强度的检测1.1实验对象采用孕激素联合hCG法制作P-COS模型的SD雌鼠作为研究组［3］,相应SD雌鼠作为对照组。1.2实验方法1.2.1血清相关指标测定大鼠于42日龄左右,阴道涂片示动情间期当晚8∶00禁食,次晨8∶00称重。腹腔注入10%水合氯醛麻醉,行腹主动脉取血5~8ml,静置30min后将全血3000r/min离心10min得血清。用ELISA方法测定空腹血糖值(Fast-ingbloodglucose,FPG)、血胰岛素(Fins);放射性免疫法检测血清黄体生成素(Luteinizinghormone,LH)和卵泡刺激素(Folliclestimulatinghormone,FSH);化学发光法检测血清雌二醇(Estradiol,E2)、孕酮(Progesterone,P)及睾酮(Testosterone,T)水平;计算LH/FSH及HOMA-IR指数(HOMA-IR=FPG×FINS/22.5)。将经病理证实建模成功的大鼠共37只按HOMA指数由小到大排列,取前10只和后10只,中间17只大鼠剔除实验;对照组随机取10只。按照α=0.05的标准,将其分别与对照组行两t检验,成功分为三组:与对照组无统计学差异的为PCOS无IR组(n=10),有统计学差异的为PCOS并IR组(n=10),对照组(n=10)。1.2.2卵巢组织免疫组织化学分析将入选大鼠卵巢石蜡包埋,切片;采用免疫组化Envision法进行检测,按照ChemMateTMEnvision+HRP或DAB检测试剂盒说明书进行,工作浓度为1∶20,以细胞质中有棕黄色或者棕褐色颗粒出现为阳性表达。1.2.3单卵泡AMH与Ir表达强度比较高倍镜下(×200)每张免疫组化图片中计数卵泡直径<5mm的窦前卵泡5个,计算每个卵泡阳性单位(PU值),则每张图片的PU=1/5(PU1+PU2+PU3+PU4+PU5),图像分析采用LeicaQwin计算机图像分析系统自动测试。高倍镜下(×200)随机取5个单卵泡视野,计算阳性单位(PU)行AMH和Ir表达强度的半定量分析。PU=(Gα-Gβ)/Gmax×100,Gα为待测部分平均灰度,Gβ为背景平均灰度,Gmax=256为检测仪器的最大灰度。1.2.4卵巢局部AMH与Ir表达强度比较同一大鼠卵巢制备的2张切片分别行AMH和Ir的免疫组化,取相同放大倍数(×20)同等面积,尽量选取2~3处相同区域,分别计算此区域AMH和Ir表达强度的PU值,最后取平均值。可表示每一卵巢的AMH和Ir表达强度,进行比较和相关性分析。1.3统计学处理所有数据均以x－±s表示,采用SPSS13.0软件进行数据统计分析,组间差异比较时,若数据符合正态分布,采用t检验和方差分析,若数据不符合正态分布,经LN数学换算,若新变量符合正态分布,仍采用t检验和方差分析,否则采用Mann-whitneyU检验和Kruskal-Wallis检验。以P<0.05为有统计学差异。2amh表达强度的相关性分析2.1血清指标检测结果三组间LH/FSH水平无明显统计学差异,实验组T及Fins水平明显高于对照组(P<0.05);PCOS无IR组FPG水平与对照组无明显统计学差异(P>0.05);PCOS并IR组的血清T和Fins较无IR组更高(P<0.05)。见表1。2.3卵巢局部AMH表达及与Ir表达强度比较及相关性分析由表3可知,实验组与对照组相比卵巢局部AMH表达有显著的统计学差异;对照组、P-COS无IR和PCOS合并IR三组间经多样本t检验知三组间卵巢局部AMH表达有统计学差异,三者间呈一递增型阶梯样分布(P<0.05,见表2、3)。而各组别相比,Ir均无统计学差异(P>0.05)。行二者间相关性分析,结果显示卵巢局部AMH表达强度与Ir表达强度无明显相关性(r=0.000,P>0.05)见图1、2。2.4卵巢单卵泡AMH与Ir表达强度比较及相关性分析PCOS合并IR、PCOS无IR、对照组三组间经多样本t检验知,单卵泡的AMH及Ir表达均无统计学差异(P>0.05);行二者间相关性分析,结果显示单卵泡AMH表达强度与Ir表达强度无明显相关性(r=0.011,P>0.05)。见表4,图3、4。3amh与ir的相互作用我们的前期研究对PCOS模型血清及卵巢局部AMH水平与胰岛素抵抗水平的关系进行了初步分析,结果表明,不管是否合并IR,PCOS大鼠实验组的血清AMH明显高于对照组,且与HOMA指数、血清T及FIns水平呈正相关［3］。提示血清AMH水平与高雄激素和高胰岛素血症之间存在一定的相关性。为进一步探讨在卵巢局部及单卵泡AMH与Ins之间的相互调节作用,本研究对PCOS模型卵巢局部及单卵泡AMH表达与IR的关系进行了初步分析。3.1卵巢局部AMH表达与IR的相关性AMH是转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员,在女性中仅表达于卵巢,通过降低生长卵泡对FSH的敏感性来参与卵泡生长发育。Hart［4］的研究发现,PCOS患者血清中AMH水平与血清中雄激素水平和胰岛素水平呈正相关［4］。我们的研究结果表明:不管是否合并IR,PCOS组与对照组相比,血清FIns均有显著性差异(P<0.05),表现为代偿性胰岛素升高(CHI),而空腹血糖无显著差异;对照组、PCOS无IR组和PCOS合并IR组三组卵巢局部AMH表达呈递增型阶梯样分布(P<0.05),提示卵巢局部AMH表达与血清胰岛素水平呈正相关,其表达受血中Ins水平的调控。在PCOS患者中,过高的Ins促进了卵泡的募集［5］,而卵泡募集的增加导致小窦卵泡的数量增多,小窦卵泡募集的增加会产生相当数量的AMH。AMH抑制颗粒细胞芳香化酶活性,一方面降低了卵泡对FSH的敏感性,导致卵泡发育受阻,优势卵泡选择失败;另一方面使雄激素合成增加,雄激素可刺激小窦卵泡数目增加产生更多AMH,AMH与雄激素之间形成一种正反馈的恶性循环［3］。提示AMH和Ins二者的相互作用均可能与PCOS患者的高雄激素特征有关,推测在卵巢局部AMH、Ins和雄激素三者之间形成一个网络,相互影响,其具体机制尚待进一步探讨明确。3.2卵巢单卵泡AMH表达与IR的相关性目前研究就PCOS单个卵泡中的AMH水平变化存在不同看法:李键等研究表明PCOS单个卵泡中的AMH显著升高［1］,但Pigny等［6］认为PCOS患者中血清AMH水平升高是由于小窦卵泡数目的增加,而各个卵泡分泌的AMH量仍在正常范围内。目前的临床研究表明,对PCOS患者予以短期胰岛素增敏剂Metformin治疗,可有效改善高雄激素血症、减少窦前卵泡数量,提高Ins敏感性,改善IR［7］;长期Met-formin治疗则有望降低AMH水平［8］。本研究结果表明,建模的PCOS大鼠单个卵泡AMH水平在P-COS无IR、PCOS合并IR及对照组之间未见明显差异。推测在PCOS患者中,在高胰岛素的作用下,垂体分泌LH增高,促进卵巢雄激素合成;在原始卵泡期,雄激素促进多个卵泡生长,单卵泡中AMH的合成量不受影响,由于卵泡数目增加,使卵巢局部表现为AMH和胰岛素抵抗水平的正相关性,而单卵泡的AMH表达无明显变化。3.3Ir表达与IR的相关性胰岛素可刺激类固醇激素分泌,在各级卵泡细胞膜表面及卵巢间质均有Ir的表达,对卵巢功能的调节发挥着重要作用。其生理作用的发挥依赖于Ins和Ir的特异性结合,机体发生IR时,胰岛素代谢途径出现不协调,表现为促代谢作用途径受损,促分裂途径发生放大现象。吴效科等［9］研究证实,PCOS颗粒细胞中胰岛素功能表现选择性缺陷,促代谢途径存在抵抗而促分裂途径增强。早期研究认为,PCOS代偿性高胰岛素将降调节Ir数目,IR主要由Ir数目减少引起。目前普遍认为PCOS的Ir数目并没有减少。我们的实验研究结果也表明,不管是否合并IR,PCOS组与对照组相比,卵巢局部和单卵泡Ir表达均无统计学差异(P>0.05);相关性分析显示卵巢局部及单卵泡AMH表达强度与Ir表达强度无明显相关性(r=0.000,P>0.05)。与李小永等人［10］的观点一致。裴全秀［11］认为,PCOS患者的InsR功能可能正常,但受体的异常丝氨酸磷酸化可能损害信号传导。而朱亮等［12］从表观遗传学角度发现,PCOS的IR不仅仅发生在受体后水平,Ir本身也有功能异常,表现为Ir基因甲基化异常。支持IR产生的原因与Ir本身结构或功能异常,或受体后缺陷等原因有关。我们的研究结果表明,不管是在卵巢局部或单卵泡,Ir数量表达与AMH表达和IR无相关性(P>0.05);而卵巢局部AMH表达与血清胰岛素水平呈正相关;在单卵泡的AMH表达无明显变化。提示PCOS卵巢局部AMH的高表达与高胰岛素血症的发生具有相关性。推测在AMH与IR的相互作用中,AMH可能阻碍了雄激素向雌激素转化,与高雄激素之间形成正反馈［1］;同时多囊卵巢自身IR也加重高雄激素发生［2］。卵巢局部在高雄激素的刺激下小窦卵泡数目增加,使卵巢局部产生更多AMH而单个卵泡的AMH无明显变化;过高的胰岛素使垂体分