高效液相色谱-质谱联用法测定大鼠灌胃给药的生物利用度

高效液相色谱-质谱联用法测定大鼠灌胃给药的生物利用度

延续是中国传统的中药，来自四川连续植物的延续（c.y.cheng等t.m.ai）。可作为连续药物的主要活性成分，连续甾醇d含量最高。进一步提取甾醇具有促进成骨细胞复制和分化的作用。口服生物使用率低，关于药物代动力学的报道也很少。在文献中，没有关于动物饲料的绝对生物利用度的文章。在这项工作中，使用高效液相铬联合使用方法（lc-ms-ms）确定大鼠血浆中药物浓度，并检测插入小鼠胃的绝对生物利用度。1仪器和试剂盒1.1高效液相色谱3200QTRAP型液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源（ESI）以及Analyst1.5数据处理软件（美国AppliedBiosystem公司）；Agilent1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵、自动进样器、切换阀（美国Agilent公司）；Eppendorf离心机（Eppendorf5415D，德国）；YKH-型液体快速混合器（江西医疗器械厂）1.2替米沙坦对照品，初创期生产木通皂苷D标准品（批号：111685-20103，纯度：93.5%，中国药品生物制品检定所）；内标替米沙坦对照品（Sigma公司，批号074K47102，含量大于99.0%）；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯．1.3动物雄性SD大鼠，质量：（200±20)g（北京大学动物部）．2方法和结果2.1流动相aglent色谱柱：XDB-C18柱（5μm,150mm×4.6mm，美国Agilent公司）；流动相：5mmol·L-1乙酸铵含φ=0.1%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脱（见表1）；流速：1.0mL·min-1；柱温：35℃；进样量：20μL.2.2木通皂苷定量离子对质荷比的影响离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：多重反应监测（MRM）；检测方式：正离子检测方式；离子喷射电压：5500V；源内气体1(GS1,N2）压力：345kPa；源内气体2(GS2,N2）压力：379kPa；气帘气体压力：138kPa；离子源温度：550℃；木通皂苷定量离子对质荷比（A/Z):946.4→455.3(DP电压：80V;CE电压：35eV）；内标替米沙坦定量离子对（A/Z):515.1→276.1(DP电压：35V;CE电压：50eV）．相应的二级全扫描质谱图见图1.2.3替米沙坦储备液的配制精密称取10mg木通皂苷D标准品，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成100μg·mL-1的储备液．2）内标溶液精密称取10mg替米沙坦对照品，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成100μg·mL-1的储备液，取适量替米沙坦储备液用甲醇稀释至100ng·mL-1.2.4lc-ms/ms分析精密量取血浆样品50μL置于1.5mLEP管中，分别加入50μL100ng·mL-1的内标溶液和50μL甲醇溶液，涡旋1min后16100g离心5min，取上清液进行LC-MS/MS分析，进样量为20μL.2.5理论与实践的确认2.5.1专业取空白大鼠血浆样本50μL、大鼠给药后收集的血浆样品，按“2.4”项下操作．结果表明：内源性物质不干扰木通皂苷D和替米沙坦的测定.2.5.2标准曲线方程的建立分别取木通皂苷D储备液适量，用甲醇稀释，配制0、10、30、100、200、500、1000ng·mL-1标准系列溶液，分别加入空白大鼠血浆溶液和内标100ng·mL-1替米沙坦溶液各50μL，按“2.4”项下进行涡旋、离心处理，取上清20μL在LC-MS/MS中进样．以标准曲线样本的实测峰面积与各自内标峰面积的比值（Y）对标示浓度（X）进行加权最小二乘法（1/χ2）线性回归，得到的标准曲线方程为2.5.3准确度和精密度按“2.5.2”项下操作，制备木通皂苷D低、中、高3个质量浓度（分别为30、100、800ng·mL-1）的质量控制（QC）样品，每个质量浓度6个样本，根据当日的工作曲线，计算QC样品的测得质量浓度，根据QC样品结果计算本法的准确度与精密度，结果见表2.2.5.4提取回收率取空白血浆50μL，制备低、中、高3个质量浓度的质控样本，每个质量浓度3个样本；同时另取空白血浆50μL，经甲醇沉淀蛋白后将上清液40℃下氮气吹干，加入50μL蒸馏水，再加入相应浓度的质控和内标溶液，处理后进行LC-MS/MS分析，获得回收率样本相应峰面积，提取回收率为质控样本峰面积与回收率样本峰面积之比；以蒸馏水代替空白血浆，按回收率样本前处理方法进行样本前处理，进行LC-MS/MS分析，获得基质效应样本相应峰面积，基质效应为回收率样本峰面积与基质效应样本峰面积之比与1的差．木通皂苷D低、中、高3个质量浓度提取回收率分别为（108.1±9.5)%,(95.3±9.9)%,(103.6±8.6）%，内标替米沙坦提取回收率为（96.5±3.2）%．木通皂苷D和内标替米沙坦低、中、高3个质量浓度的基质效应分别为-8.57%、-1.96%、-3.63%，内标替米沙坦的基质效应为-2.38%．结果显示：血样中木通皂苷D和内标替米沙坦提取回收率均较高且稳定，血样中基质对木通皂苷D和内标替米沙坦的基质效应较小，均不影响准确测定．2.6木通肥皂d大鼠腹腔给药血浆中药物质量浓度的测定2.6.1血药浓度测定取雄性SD大鼠按体质量随机分为2组，每组6只大鼠，分别口服灌胃和静脉注射给予木通皂苷D水溶液，给药剂量为100mg·kg-1，口服组于20、40min、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24h眼眶取静脉血，静脉注射组于5、10、20、30min、1、2、4、6、12、24h眼眶取静脉血，每次取血约0.5mL置于肝素化EP管中，5900g离心10min，取上清血浆样本50μL，按“2.4”项下处理，取上清20μL在LC-MS/MS中进样．将实测峰值面积与各自内标峰面积的比值代入上述标准曲线方程，计算血药浓度，平均血药浓度-时间曲线见图2，其中口服组12h后血药浓度低于最低定量限．2.6.2木通皂苷d水溶液大鼠灌胃生物利用度数据处理采用生物利用度研究数据处理通用程序（简称BAPP2.0，由中国药科大学药代中心提供）计算药时曲线下面积AUC0-t和AUC0-INF,tmax和ρmax采用实测值．口服生物利用度（f）为口服组AUC0-INF与静脉组AUC0-INF之比．结果见表3．结果表明木通皂苷D水溶液大鼠灌胃给药的f很低，仅为0.13%.3灌胃给药后的生物利用度检测木通皂苷D为皂苷类化合物，大鼠口服灌胃给药后f很低，很难用高效液相紫外检测（LC-UV）的方法进行体内血浆样本的分析．LC-MS/MS与之相比具有明显的优越性，检测灵敏度高、专属性强、需用血浆量较少，为木通皂苷D的临床前研究提供了稳定可靠而又方便易行的检测手段．Li等报道了LC-MS/MS法检测血浆样本中木通皂苷D浓度的方法，并检测了木通皂苷D大鼠灌胃给药后的不同时间点血药浓度，但未检测其注射给药后的血药浓度，因此未能计算灌胃给药的绝对生物利用度．本研究给药剂量和灌胃给药取血时间点与Li等报道的相同，但结果不完全一致．文献报道木通皂苷D的tmax为1.2h，而本研究发现木通皂苷D灌胃给药未见明显吸收峰，可能是由于其f非常低，而在小肠上段吸收较多有关．我们为了提高灌胃给药的f，在后续的试验中加入了一定浓度的吸收促进剂进行相关试验，所得的结果也验证了这一趋势，即10～20min血药浓度即达到峰值，后面的时间点未见明