不同环境条件下羊下丘脑中催产素表达的变化

不同环境条件下羊下丘脑中催产素表达的变化

动物的成熟与生殖激素密切相关。一般认为在动物性成熟前,下丘脑-垂体-性腺轴的功能被较低浓度的性激素所抑制,因为此时下丘脑-垂体对性腺激素的敏感性较高;而动物性成熟时,下丘脑-垂体对性腺激素的敏感性较低,从而下丘脑-垂体-性腺轴的功能被激活,下丘脑内促性腺激素释放激素(gonadatropinreleasinghormone,GnRH)的分泌增多,垂体内促卵泡素(folliclestimulatinghormone,FSH)和促黄体素(luteinizinghormone,LH)分泌也随之增多,从而促进性腺的发育和性激素的分泌;同时,血浆中雌二醇(estradiol,E2)和睾酮(testosterone,P4)的浓度升高,并刺激各靶器官的发育。研究表明,下丘脑内催产素的分泌增加,也可以提高垂体内LH和FSH的峰值,并且催产素增加垂体内LH的分泌,LH和FSH的分泌增加,使性腺激素的分泌增加。研究表明,羔羊期、青年期、妊娠中期奶山羊下丘脑中催产素表达分布广泛,但性成熟期下丘脑内催产素(oxytocin,OT)的分泌比羔羊期是否增加尚未见报道。本试验用免疫组化链霉素抗生物蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)法,对羔羊期和性成熟期的奶山羊下丘脑中OT神经元的变化规律进行研究,旨在为进一步研究动物性成熟期下丘脑内OT对FSH、LH等激素的调控机理提供形态学资料。1材料和方法1.1sp法检测脑电sp法羔羊期(2月龄到3月龄)和性成熟期(6月龄到8月龄,未孕)的健康雌性奶山羊各8只,临床健康,体重25kg～35kg。山羊颈动脉放血致死,向两侧颈总动脉同时注入37℃生理盐水800mL冲去残血。随后灌注4℃含40mL/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)1000mL。开颅取下丘脑后,浸入上述固定液中后固定12h。而后浸入4℃的200g/L蔗糖PB液,组织块沉底后即可切片。用冰冻切片机对下丘脑做连续切片,厚度35μm。每只羊下丘脑制得三套切片,一套做Nissl染色进行下丘脑核团定位,一套作阴性对照,一套进行免疫组化SP法染色。抗鼠SP超敏试剂盒,福州迈新公司进口分装;鼠抗OT抗体,第四军医大学神经科学研究所提供;葡萄糖氧化酶,美国Sigma公司生产。1.2方法1.2.1小鼠抗ot的制备将切片经0.01mol/L的PBS缓冲液冲洗3次,每次10min,然后按以下步骤进行反应,各步骤间均用0.01mol/L的PBS缓冲液充分漂洗3次,每次10min。①切片入A液(过氧化物酶阻断剂),室温下孵育1h。②入B液(非免疫血清),室温下孵育40min。③入鼠抗OT抗体(稀释倍数为1∶10000),4℃下孵育48h～72h。④入C液(生物素标记的二抗),37℃下孵育1.5h。⑤入D液(链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶),37℃下孵育1.5h。⑥经葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺方法呈色,室温下呈色15min～20min。然后按常规脱水、透明、封片。1.2.2比较性染色用0.01mol/L的PBS缓冲液代替鼠抗OT抗体孵育切片,其余步骤同1.2.1,进行对照试验,确定该方法的特异性。1.3阳性细胞的测定免疫组化染色结果每组切片中随机选取5个不同部位,Motic数码显微镜拍照,用江苏捷达801形态分析软件对阳性细胞进行分析,测量阳性细胞的数目和灰度值,用平均数±标准差(X¯¯¯±SD(X¯±SD)表示。所有数据输入SPSS软件进行羔羊期和性成熟期的t检验,并取P<0.05为差异显著。2结果2.1羊期和期期阳性神经元/组织型免疫组化SP法结合硫酸镍胺加强的蓝色反应,在光镜下OT免疫阳性产物呈深蓝色,主要呈颗粒状、均质状分布于细胞质中;在细胞外则呈颗粒状和小点状。阳性细胞的形态有圆形、卵圆形、多角形;有的阳性细胞突起明显。羔羊期和性成熟期催产素免疫反应阳性神经元共同分布于室旁核、视上核、腹外侧核、乳头体后核和乳头体内侧核等(图1,表1)。另外,室周核、前联合核、视前内侧核、视前外侧核、下丘脑前区、下丘脑背区、下丘脑小细胞核、背内侧核在羔羊期可见催产素免疫阳性神经元分布,但在性成熟期未见分布。2.2评估小鼠脑周核及细胞计数羔羊期催产素免疫反应阳性神经元主要分布在室旁核、视上核,而性成熟期催产素免疫反应阳性神经元则主要分布在室旁核、视上核、下丘脑外侧区、腹外侧核、乳头体后核和乳头体内侧核。除了室周核、视前交叉上核、交叉上核和前联合核等核团,性成熟期时下丘脑的其他核团中催产素免疫阳性神经元都显著高于羔羊期(表1)。羔羊期催产素平均灰度值在视上核、室旁核、下丘脑外侧区等核团低于性成熟期(P<0.01),而在视前交叉上核、后穹窿周核等核团高于性成熟期,且大部分都差异显著(P<0.01)。羔羊期下丘脑细胞总平均数为891.5,性成熟期为2042,显著高于羔羊期的平均细胞数目。在奶山羊羔羊期室周核、前联合核、视前内侧核、视前外侧核、下丘脑前区、下丘脑背区、下丘脑小细胞核、背内侧核有OT阳性表达,在性成熟期无表达。3不同生理期ot神经元的分布对于动物性成熟机理,一般认为性成熟前,性腺发育不全,下丘脑-垂体-性腺轴处于抑制状态,到了性成熟期,下丘脑-垂体-性腺轴的功能被激活,GnRH、FSH和LH分泌升高,FSH和LH促进了相应性激素的分泌和性腺的发育成熟。催产素是下丘脑-垂体-性腺轴中一个重要的生殖激素,研究表明,催产素在发情周期存在波动,且下丘脑内催产素神经元数目也具有波动性。本试验发现羔羊期和性成熟期OT免疫阳性神经元在室旁核、视上核等下丘脑的大部分核团均有分布,这与妊娠中期、青年期下丘脑内OT免疫阳性神经元的分布基本上一致。但是羔羊期OT免疫阳性神经元在室周核、前联合核、视前内侧核等少数核团见分布,而性成熟期则无分布。结果提示,羔羊期和性成熟期OT在下丘脑分布相当广泛,但不同生理期OT神经元的分布存在差异。研究发现,动物处在不同的生理周期,其细微结构会有所变化,主要表现在神经元的位置、数目、大小、树突分支的情况、阳性神经纤维的数目、细胞膜内在成分和突触数方面的变化。母猪从出生后到繁殖早期下丘脑内OT神经元的大小、体积、数目均持续增加。本研究发现从羔羊期到性成熟期奶山羊下丘脑各核团内OT神经元的数目基本上都在增加。另外,下丘脑各个核团的催产素的平均灰度值的结果比较表明,各个核团催产素的分泌在室旁核、视上核等部分核团在羔羊期似乎比性成熟期多,但是如果考虑到各个核团的OT神经元在性成熟期比羔羊期多1.4倍～8.4倍,就可以认为这些核团催产素的合成和分泌其实是性成熟期比羔羊期多,这可能与羔羊期性腺刚发育有关。研究报道催产素可以增加LH和FSH的峰值,并且催产素增加垂体内LH的分泌,LH和FSH的分泌增加便促进性腺激素的分泌和性腺的发育。性成熟期下丘脑内OT是否也直接促进GnRH