芹菜素抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药敏试验研究

芹菜素抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药敏试验研究

杏仁素是一种黄酮类化合物，也被称为黄酮类化合物和黄酮类化合物。其化学结构为5,7,4-三羟基黄酮,分子式C15H10O6。大量实验证明芹菜素具有广泛的药理作用。研究报道其对中枢神经系统具有镇静作用,对皮质神经元具有保护作用,对心血管系统具有降压作用和预防动脉粥样硬化作用;抗菌、抗病毒作用;抑制肿瘤细胞,血管形成和生长作用;抗氧化作用,雌激素样作用等。本文就芹菜素的抗菌作用做深一步研究。近年来,抗生素的不合理应用导致出现的耐药菌已引起国内外学者的广泛关注。就临床检验分析可知,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是造成许多重症感染的主要病原菌之一,其多重耐药的特性使得其对除万古霉素等少数几种抗生素以外的药物均不敏感,所以寻找有效的、低副作用抗菌药物迫在眉睫。目前我们的工作正致力于从植物中寻找有抗MRSA活性的化合物,也做出了一些成果,其中黄酮类的抗菌效果比较出色。本实验将芹菜素作用于10株从临床重症感染患者中分离出的MRSA菌株,利用头孢西丁纸片法和微量稀释棋盘法等药敏试验方法将芹菜素与各类抗生素联合作用,观察其是否存在协同作用,能否在合用时减少抗生素用量,从而减轻不良反应带来的不利影响。1材料表面1.1药物、试剂和仪器芹菜素:经柱层析分离提纯至紫堇属植物金钩如意草,根据活性追踪的方法得到活性单体,经与参考文献波谱对照一致,确定为芹菜素,纯度≥98%。注射用盐酸左氧氟沙星注射液(扬子江药业集团有限公司,批号10020301);乳酸环丙沙星氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司,批号1151020609);注射用硫酸阿米卡星(江苏吴中医药集团有限公司,批号H19983021);注射用硫酸庆大霉素(广州白云山天心制药有限公司,批号091020800);硫酸依替米星注射液(无锡济民可信山禾药业股份有限公司,批号H19991423)。M-H水解酪蛋白琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司,批号091104),M-H肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司,批号20100413);二甲基亚砜(DMSO,天津化学试剂有限公司,批号20070924)。1.2药代动力学鉴定MRSA:MRSA8、MRSA82、MRSA98、MRSA111、MRSA135、MRSA144、MRSA166、MRSA187、MRSA189、MRSA321(成都军区昆明总医院药学部微生物室临床分离得到并鉴定)。2方法和结果2.1外药物敏感试验2.1.1dmso与培养液复合膜的制备倍比稀释法测MIC:从打孔法得到的结果并查阅文献估算测定MIC时的首孔浓度,计算所需样品的量。用不超过30%的DMSO溶解,然后加入适量的培养液配成溶液,震荡器混匀。依次倍比稀释,弃去最后一列的稀释液体100μL,然后在各行加入不同菌液100μL。另设阴性(只加培养液)、阳性(菌液加培养液)对照及DMSO对照组(观察DMSO对细菌的影响)。最后放置于35℃恒温箱中培养18~24h后取出进行观察,肉眼可见清澈透明者视为无菌生长(实验前药液清亮透明),药液不澄清的需涂片在显微镜下加以观察,以无细菌生长的最低药物浓度为该药物的最低抑菌浓度。2.1.2dmso溶液配制单药法取101定性滤纸,用打孔机制成直径为6mm的圆型小纸片,放入干燥洁净的小药盒中,高压灭菌(121℃,15min)备用。纸片含药量根据MIC来确定。将芹菜素用DMSO溶解,配置成单药,纸片上所含的药量浓度为其最小抑菌浓度。将配好的菌液均匀地划线于整个M-H平板上,将抗生素纸片均匀地贴在培养皿上,再将做好的含药液纸片与抗生素纸片相隔3cm左右的距离贴上,置于温箱里培养18~24h,观察记录结果。2.1.3药物相互作用采用微量稀释棋盘法(chequerboardmicrodilutionassay)即联用的2种药物于96孔平底微量培养板上以二维棋盘的纵向(A至H)横向(1至12)2个方向分别进行2倍的倍比稀释。根据所测定的两药单独对受试菌的MIC,以两药各自4MIC到1/16MIC分别进行联合。药物体外的相互作用方式以部分抑菌浓度指数(fractionalinhibitoryconcentrationidex,FICI)来判定,分级抑菌浓度为2种抗菌药物的联合药敏指标。FICI的计算与判读标准:分别读取两点,A药联用的最低MIC和B药联用的MIC分别记为MICA及MICB。两药单用时的MIC分别记为A、B。FICI=MICA/A+MICB/B。FICI≤0.5,两药为协同;0.5<FICI≤1,两药为相加;1<FICI≤2,两药为无关;FICI>2,两药为拮抗。2.2结果2.2.1mrsa菌株的鉴定按CLSI颁布的头孢西丁纸片扩散法标准操作。结果如表1所示。2.2.2紫菜素抗菌药物联合抗菌药物根据药理学实验方法中的纸片法,初步测定两药是否有联合作用,将芹菜素与15种抗菌药物纸片作用,发现芹菜素与喹诺酮类抗菌药物和氨基糖苷类抗生素联合效果较好。下一步可根据纸片法联合实验的结果作为参考,进一步用微量稀释棋盘法验证其具体的协同作用(表2)。2.2.3联合实验的结果根据纸片联合实验的结果选取具有协同作用的抗菌药物进一步确定其联合作用,结果见表3。3从抗菌药物的联合应用来看,菜芹菜素是一种广泛存在于自然界中的天然黄酮类化合物,且易于人工合成,体外研究和动物实验显示芹菜素具有抗肿瘤、抗炎症、降血压、抗动脉硬化和血栓症、抗焦虑、抗菌、抗病毒以及抗氧化作用等多方面的生物学活性,而且其致畸变毒性与其他黄酮类化合物相比相对较低。许多对芹菜素抗菌活性实验的研究表明:芹菜素具有广谱抑制G+菌、G-菌和一些耐药菌作用,芹菜素对多种革兰阴性菌具有抑制作用,其中对于阴沟肠杆菌(E.cloacae)及肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的杀菌作用最强,最低抑制浓度(MIC)可达4μg·mL-1,但其杀菌作用的机制尚不清楚。另有抗菌试验表明,芹菜素对革兰阴性菌的抑制作用比对革兰阳性菌的作用强,对耐受传统抗生素的菌群(如铜绿假单胞菌等)也有抑制作用,同时对耐甲氧西林和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌都有选择性抑制作用。BasileA等发现芹菜素对产气肠杆菌(ATCC13048),E.cloacae(ATCC10699),铜绿假单胞菌(ATCC27853)对芹菜素最敏感(MIC为64μg·mL-1),对大肠杆菌(ATCC11229)和肺炎克雷伯菌(ATCC10031)的MIC为128μg·mL-1。对产气肠杆菌的MIC为4μg·mL-1,铜绿假单胞菌为8μg·mL-1,奇异变形杆菌为16μg·mL-1,伤寒沙门菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌为128μg·mL-1。Sato等对黄岑提取物的研究中发现,其中的芹菜素对耐甲氧西林和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌都有选择性抑制作用(MIC为3.9~15.6μg·mL-1)。但对芹菜素的联合抗菌作用,特别是临床上常见的耐药菌的研究未见报道。由实验结果可得出:芹菜素与喹诺酮类抗菌药物和氨基糖苷类抗生素呈现良好联合抗菌作用,与左氧氟沙星的联合应用时,10株MRSA菌株有4株显示联合作用,且抗菌药物的用量也都降低到1/2~1/8MIC不等;与环丙沙星联合应用时,有3株菌的FICI值小于0.5,显示有协同作用,环丙沙星的用量也降低到1/2~1/8MIC;与氨基糖苷类抗生素庆大霉素联合应用时,有4株菌呈现协同抗菌作用,同样也降低抗生素的用量到1/2~1/8MIC;与阿米卡星联合应用时,有6株菌呈现协同抗菌作用,抗生素的用量最低可降到单独用药时的1/16;与依替米星联合应用时,有5株菌呈现协同抗菌作用,其余为相加作用,抗生素的用量也分别降低了1/2~1/8MIC不等。抗生素用量的降低可减轻抗生素滥