广西本地黄牛催产素的分泌释放途径

广西本地黄牛催产素的分泌释放途径

催产素（ot）是核电站中发现并澄清结构的神经遗产，由脑神经内侧的大细胞产生。这是一种由九个氨基酸组成的特殊结构的环状激素，分子质量为1047u。OT在中性或碱性溶液中容易被破坏,而在酸性溶液中较为稳定,在体内容易被消化酶和血液中的催产素酶所破坏。荷兰著名大脑研究学者Swaab等首次利用免疫组化方法对小鼠的下丘脑催产素能神经元进行了定位描述。陈树林等用原位杂交方法对成年发情期奶山羊下丘脑催产素及其表达测定发现了催产素mRNA的广泛存在。越来越多的研究结果表明,OT样神经元广泛存在于下丘脑中的视上核、室旁核、弓状核等27个核区。另外,研究还发现下丘脑OT可经神经垂体、第三脑室、血管3条途径释放,然后经血液循环最终作用于靶细胞而发挥生理作用。OT是一个最早被弄清楚的氨基酸序列,它有43种转录体,并且是能够人工合成的肽类激素。随后,对OT的研究进展极快,OT不仅能调节神经内分泌,而且与繁殖及育幼相关的行为和复杂的社会行为密切相关。目前除了已明确哺乳动物神经垂体存在OT外,在其他许多脊椎动物的神经垂体内也发现存在着一些结构和功能方面与OT类似的激素。迄今为止,关于OT的研究大多集中在OT的生理功能、临床应用的研究,基础研究的资料较少;关于OT在不同动物种属中基础研究方面,鼠和奶山羊的资料比较完整,而有关OT在牛体内的报道较少,国内外尚无OT在广西本地水牛下丘脑-垂体-卵巢轴的研究报道。鉴于此,笔者进行了OT在广西本地水牛下丘脑-垂体-卵巢轴的免疫组化定位的差异性研究,为培育广西奶水牛提供基础理论依据。1材料和方法1.1试验动物1～2年龄广西本地青年水牛(沼泽型)5头,临床健康,雌性,购于广西壮族自治区南宁市肉联厂,体重约300kg。1.2方法1.2.1免疫组化试验将广西本地水牛颈动脉放血致死后迅速取下牛头,打开颅腔取出完整牛脑,分离下丘脑,用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定3d;将取出的下丘脑在梯度酒精中脱水,二甲苯透明,石蜡包埋;将包埋好的蜡块作矢状连续切片,片厚5μm,隔6取2,得到3套切片。第1套用于免疫组化;第2套作免疫组化阴性对照,用来确定试验的特异性反应;第3套作Nissl染色,用于下丘脑的核团定位。核团定位参照BenGreenstein编写的《ColorAtlasofNeuroscienceandNeurophsiology》、田九畴主编的《畜禽神经解剖学》、张培林主编的《神经解剖》及潘堂峰硕士论文《摩拉杂交水牛和广西本地水牛下丘脑神经核团形态学及细胞构筑比较研究》中的描述。1.2.2有机热试验将广西本地水牛颈动脉放血致死后迅速取下牛头,打开颅腔剥离脑硬膜并暴露脑神经,切断视交叉前部2条视神经、脑神经和垂体漏斗,暴露大脑底,切开鞍膈,取出牛脑,分离并取出垂体,用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定12h。打开腹腔,迅速取出卵巢,延其纵轴将卵巢一分为二,用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定12h。垂体和卵巢的处理同下丘脑。第1套用于免疫组化;第2套作阴性对照,用来确定试验的特异性反应;第3套作HE染色,用于常规组织学观察。1.2.3催化剂的制备将下丘脑、垂体、卵巢等组织切片依次浸入下列试剂:二甲苯(I)10min→二甲苯(Ⅱ)10min→二甲苯(Ⅲ)10min→100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→70%乙醇5min→60%乙醇5min→50%乙醇5min→蒸馏水洗2min→PBS冲洗3次,每次5min→高压修复1～1.5min→冷却PBS冲洗3次,每次5min→3%过氧化氢20min→PBS冲洗3次,每次5min→封闭→滴加一抗,37℃恒温箱孵育90min→PBS冲洗3次,每次5min→滴加二抗,37℃恒温箱孵育30min→PBS冲洗3次,每次5min→DAB显色(在显微镜下观察)→水洗10min→苏木精染色2～5min→自来水洗1min→1%盐酸酒精分化数秒→自来水洗1min→烘干→中性树脂封片。阴性对照试验以0.01mol/LPBS液(pH值7.4)替代一抗,其他步骤同上。1.2.4用于检测图像面积、细胞数病理图像分析仪由数码显微镜及LEICQWIN图像分析系统2部分组成,图像分析软件可以测量数量、直径、面积、灰度值、光密度等指标。将制得的切片在数码显微镜下观察并拍照,将获得的图像存于计算机,用美国MediaCybernetics公司的Image-ProPlus6.0进行分析。Image-ProPlus自动测得所获取图像的面积(即视野面积)为59142.67μm2,高倍镜(×40)下测量该图像中阳性细胞大小(以平均直径表示)、阳性细胞光密度值(不同于灰密度,光密度值越大,其阳性程度越高)等,低倍镜(×10)下测量图像中阳性细胞数(以具有细胞核细胞为准,压线者亦记在内),结果用平均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示。每套切片随机抽取5张,其中下丘脑切片每个核团随机取5个视野图像,数据用SPSS统计分析软件进行统计分析。2结果与分析2.1组织病理学检测经免疫组织化学SuperPicTureTM二步法检测染色的切片,背景呈浅黄色或浅黄褐色,OT免疫反应阳性神经元呈深浅不等的黄褐色,根据胞体内反应颗粒着色的深浅可分为强阳性、中等阳性和弱阳性3种。强阳性细胞黑褐色,胞体内深褐色颗粒融合成团,染成一片;弱阳性细胞着色浅淡,细胞轮廓不清,在高倍镜下方可见到胞质中有少量浅褐色颗粒中等阳性细胞介于两者之间;对照组切片均为阴性,说明此方法结果可靠。光密度值表示阳性细胞着色程度,值越高,阳性细胞着色越深(表1)。2.1.1小鼠视上部细胞发育的特点下丘脑视上核(supraopticnucleus,SON)位于丘脑下部的基部,即下丘脑的视上区。其细胞属分泌神经元,纵贯视前区、视上区和结节区嘴侧部,横跨内外侧带,包绕视交叉,呈一连续的长扁平板状核团。沼泽型水牛该核细胞体积较大,细胞密集,阳性细胞呈强阳性,短梭形,胞质内可见大小不一的阳性颗粒(图1)。2.1.2视上区的内核室旁核(Paraventricularnucleus,PVN)位于内侧带靠近室周带处,即视上区的背中部,在视前核后上方、前核上方、背内侧核上端的前方、室间孔的下方,呈卵圆形的核团。沼泽型水牛该核细胞胞核清晰可见,核仁清楚,细胞染色较深,OT免疫阳性细胞呈不明显的空泡状,颗粒丰富,多见三角形或四边形细胞,偶见梭形,突起明显,细胞间分布较松散,周围有很多阳性纤维。2.1.3小细胞细胞组交叉上核(Nucleussuprachiasmaticus,SCH)位于视交叉上方,主要由呈梭形和卵圆形排列密集的小细胞和少量大细胞组成。沼泽型水牛该核细胞突起粗大、长、纤维多,OT免疫阳性产物主要分布于梭形的大细胞中,另外在一些无突起的小细胞中也有分布,细胞形态各异,体积中型,中等阳性,OT免疫阳性细胞染色深而密集,周围可见阳性纤维。2.1.4视前外侧核及pol的特性视前核(Preopticnucleus,NPO)位于视交叉上方,前核的前方,又分为视前内侧核(Medialpreopticnucleus,POM)及视前外侧核(Lateralpreopticnucleus,POL),两者之间无明显界限,整个核团由上至下呈梭形。沼泽型水牛该核细胞以中型细胞为主,细胞主要为梭形和卵圆形的小细胞,分布较松散,细胞成短梭形,胞质染色浅,胞核着色浅,可看到清晰的核仁。2.1.5nhp的核型后核(Posteriorhypothalamicnucleus,NHP)位于背内侧核后方,乳头体上方,呈宽带状的核团。沼泽型水牛该核细胞以中型细胞为主,细胞主要为梭形和卵圆形小细胞,细胞胞质染色浅,胞核着色浅,可看到清晰的核仁,OT阳性细胞呈中等阳性,短梭形,分布较松散。2.1.6充腹外侧部弓状核(Arcuatenucleus,ARC)位于视交叉后方,腹内侧核下方,乳头体前方,呈梭形横卧于下丘脑腹侧部。沼泽型水牛该核细胞分布较密集,OT阳性细胞呈强阳性,细胞体积较大,细胞形态以梭形、圆形、卵圆形为主,胞内胞外均有大量强阳性物质分布(图2)。2.1.7回采过程中,内核和弓状核的总体特征腹内侧核(Ventromedialnucleus,VMN),位于背内侧核及后核的下方、乳头体前上方,弓状核的背侧部,由前向后呈椭圆形的核团。沼泽型水牛该核细胞以中小型细胞为主,OT阳性细胞呈强阳性,染色较深,细胞较小,核仁呈黑色,分布较松散,胞内胞外均有大量强阳性物质分布。2.1.8底物的周围边界乳头体核(Mamillarybody,MB)为1对球形核团,突出于下丘脑底面,在下丘脑矢状面上,位于下丘脑后下方,其上方是后核,前上方是腹内侧核,前方是弓状核,核团呈圆形,其周围界限明显。沼泽型水牛该核细胞OT阳性细胞较小,分布较松散,呈中等阳性,细胞呈蝌蚪状、多角形,胞质偶见分布粗而短的阳性产物。2.1.9常网状核团的形成前核(Anteriorhypothalamicnucleus,NHA)位于视交叉上核后上方、视前核的后方、背内侧核的前方、室旁核的下方,呈后上向前下呈常带状的核团。沼泽型水牛该核细胞体积较大,细胞形态多以圆形、卵圆形、梭形为主,OT阳性细胞呈强阳性,胞核可见空泡,胞质染色较深,核仁呈黑色,细胞间分布较松散,胞浆内可见大小不一的阳性颗粒。2.1.1旁核和前核的之前和外侧核团的结构背内侧核(Dorsomedialnucleus,NDM)位于室旁核和前核的后方、下丘脑后核的前方、腹内侧核的上方,由上往下呈宽带状的核团。沼泽型水牛该核细胞以中小型细胞为主,OT阳性细胞呈强阳性,胞质染色较深,呈深褐色,细胞呈不规则分布,环绕胞体为空泡。2.2染色切片的检测经免疫组织化学SuperPicTureTM二步法检测染色的切片,背景浅黄色或黄褐色,OT免疫反应阳性产物呈深浅不等的棕黄色。对照组切片均为阴性,说明该试验具有免疫反应的特异性。2.2.1ot免疫阳性产物在垂体中的分布(1)ot免疫阳性细胞密度腺垂体是体内最重要的内分泌腺,位于脑基底部靠近视丘下部,呈樱桃状。沼泽型水牛的腺垂体上仅见数量极少、染色很淡、纤细的OT免疫阳性细胞和纤维,纤维沿腺细胞走向,分支形成不规则的网络状。在中间部的粗大纤维和血管周围被阳性物质包围(图3)。试验发现,沼泽型水牛腺垂体中OT免疫阳性纤维丰富,平均光密度较低,为0.459±0.044;OT阳性纤维密度大,为“++++”。(2)青年期开发的双组分纤维神经垂体位于脑垂体后部,主要由下丘脑束的无髓神经纤维和神经胶质分化而成的神经垂体细胞所组成。沼泽型水牛的神经垂体上可见少量呈断续平行排列的OT阳性纤维,典型的纤维内含有大小不等的棕黄色或深黄色反应颗粒,膨大成圆形、杆形、梭形等,使纤维成串珠样,或呈均质分布在纤维上,膨体所在纤维明显相连,这些纤维弯曲细小,多分布于近下丘脑区域。青年期沼泽型水牛神经垂体上的OT免疫阳性纤维分支少、较短,有的形成纤维束,但数量少,有的交叉成不规则的网状,这些纤维还在血管、血窦旁有较多分布。在OT免疫阳性纤维旁散在分布着一些黄色阳性颗粒,其大小不等,可能是被切断的纤维。沼泽型水牛OT免疫阳性纤维粗大、长,纤维束较多,阳性颗粒多,膨体较多,分支较多,所含颗粒黄褐色,其中胞核呈蓝色(图4)。2.2.2生殖被膜细胞ot免疫阳性检测经免疫组织化学SuperPicTureTM二步法检测染色的切片,背景无色或浅黄色,OT免疫反应阳性产物呈深浅不等的黄褐色,细胞呈不规则的圆形、卵圆形、梭形、三角形和多角形等,大小不等,成堆或散在分布。其中,阳性细胞大小为(16.088±0.795)μm,阳性细胞数为265.30±2.93;平均光密度为0.235±0.033,OT免疫阳性面积为(122.537±0.116)μm2。根据胞体内反应颗粒着色的深浅可分为强阳性、中等阳性和弱阳性。强阳性细胞黑褐色,胞体内褐色颗粒融合成团,染成一片;弱阳性细胞着色浅淡,细胞轮廓不清,在高倍镜下方可见胞质中有少量浅黄色颗粒;中等阳性细胞介于两者之间。卵巢位于子宫底的后外侧,与盆腔侧壁相接。试验中5头牛的卵巢皮质和髓质均未发现有OT免疫阳性产物的分布,而在生殖上皮、卵泡颗粒细胞和黄体细胞发现有大量OT免疫阳性产物存在。卵泡颗粒细胞中OT免疫阳性细胞形态为卵圆形和圆形,阳性细胞数较多,主要以强阳性细胞为主,颗粒细胞越靠近卵泡腔,平均光密度值越低。生殖上皮发现有OT免疫阳性产物分布,细胞呈立方状。沼泽型水牛卵巢生殖被膜细胞呈弱阳性。卵泡细胞胞核不着色呈空泡状,居于中央或偏于一侧,颗粒层细胞呈中等阳性(图5)。2.2.3d现行体存在的细胞毒性和形态黄体为排卵后由卵泡迅速转变成的富有血管的腺体样结构。许多学者先后对反刍家畜(绵羊、牛、山羊)的周期黄体中OT的定位进行了研究报道。卿素珠等认为奶山羊黄体中的OT免疫反应细胞属于弥散神经内分泌系统(DNES)的周围部分;李兆才等在奶山羊黄体确定了DNES细胞的存在。但目前尚无DNES细胞分泌OT的直接证据,关于OT在黄体中的表达部位尚无定论。卵巢颗粒细胞在排卵到黄体化的过程中经历了许多生化和分化方面的变化,如从排卵前增殖的颗粒细胞向非增殖的终末分化的黄体细胞的转化,OT对不同分化阶段的颗粒细胞具有分化作用。连续切片HE染色的对照观察显示,奶山羊周期黄体中的OT主要由大黄体细胞分泌,小黄体细胞也可产生少量OT,且OT阳性细胞以不规则圆形为主,兼有卵圆形、多角形等,阳性细胞主要为大黄体细胞。近年来的研究发现,黄体细胞除可分泌或表达孕酮、雌激素、前列腺素F2a和催产素等激素外,还表达一些细胞因子和激素的特异性受体。黄体中存在大量的OT免疫阳性产物,细胞以卵圆形和圆形为主。黄体细胞轮廓不清楚,着色较浅,免疫阳性物质均匀分布于整个黄体组织中(图6)。3生理功能的影响已有的关于OT生理功能方面的研究表明,OT除在生殖活动的调节中发挥重要作用外,对心血管功能、消化功能、体液渗透压、神经免疫也有调节作用,与应激反应、睡眠与觉醒、痛觉调制等有密切关系,并能改善母亲期长期空间记忆,增加人类之间的信任感,对精神失调和社会行为的破坏(如自闭症)有改善作用。生理功能的产生必定有其形态学基础,OT合成部位的研究成为该领域的热点。在该领域的动物研究方面,许多学者已对大鼠、仓鼠、树鼩、人、猪、奶山羊等多种动物的OT神经元及纤维的分布、合成部位有过研究及验证,但OT在下丘脑-垂体-卵巢轴的具体作用机制及途径还有待进一步研究。3.1ot在广西本地一核中的分布关于下丘脑OT免疫阳性神经元在动物中分布的报道很多。Monika研究发现,哺乳动物的OT神经元主要存在于下丘脑大细胞核、视上核和室旁核,其神经纤维主要投射到垂体后叶和正中隆起。陈树林等、卿素珠等在多种动物的室旁核、视上核、穹窿周核、室周核、下丘脑外侧区、下丘脑前核、环核和前联合核等观察到OT神经元,该试验也在上述区域观察到阳性神经元及数量不等的阳性纤维。试验发现OT在沼泽型水牛的下丘脑中广泛分布,视上核、背内侧核等数十个核团(区)均有分布,不仅分布在视上核和室旁核,在弓状核亦见大量OT神经元,并以弓状核分布最多。与陈树林等研究结果类似。试验还发现弓状核中存在大量OT免疫阳性神经元,而弓状核与视上核、背内侧核均位于促垂体区,该区域的内分泌细胞主要分泌促垂体激素,这提示了OT可能参与调节了垂体中某些激素的分泌。下丘脑一些血管被OT神经元及纤维环绕,在第三脑室附近的一些核团和弓状核、穹窿、正中隆起等处有一些OT神经元的突起及神经纤维。这表明OT可经第三脑室(脑脊液)、血液、神经垂体3条途径释放,然后通过血液循环作用于靶细胞,与孙志宏等研究结果一致,从而对OT释放途径有了进一步的证实。各核团神经细胞的阳性产物光密度上有显著差异,跟摩杂1代水牛研究中相应各核团的光密度也有显著差异,这表明不同核团功能区域、不同种属牛的神经元细胞因作用不同而出现内分泌功能上的差异,可能对生产性能有影响。OT在广西本地水牛下丘脑中的分布与大部分文献报道基本一致。将该试验结果与OT在不同动物下丘脑中的分布进行比较,结果表明,OT在下丘脑中的分布存在种属上的差异。OT免疫阳性神经纤维主要分布于下丘脑中弓状核、腹内侧核、前核及背内侧核等核团,其出现在与神经内分泌相关的下丘脑核团中,提示OT可能参与了机体的生殖神经内分泌的调节。3.2ot对腺垂体激素合成的调节试验发现,沼泽型水牛免疫阳