大鼠脑缺血再灌注后脑组织nos、nf-b的表达及意义

大鼠脑缺血再灌注后脑组织nos、nf-b的表达及意义

脑缺血置换术（i.r）是伤口、休克和器官疾病的常见临床现象，是一种复杂的病理生理过程。机体微循环是一个统一的、密切的、联系的网络系统,局部脑组织损伤微循环障碍可以引起全身微循环紊乱。一氧化氮(NO)是一种不稳定的“气体型分子”,生成NO需要一氧化氮合酶(NOS)的催化,高浓度NO可致脑细胞代谢障碍和病理改变。同时NO是细胞间信息传递的重要调节因子,作为第二信使和神经递质广泛地分布于中枢神经系统,NOS免疫阳性的神经元通过分泌的NO对其他递质进行调节。核转录因子(NF-κB)对全身炎症反应综合征(SIRS)的调控作用是通过参与多种细胞因子基因的转录和调控而产生影响。研究证明,脑组织臂旁核、蓝斑、杏仁核、室旁核在感受、整合和传递信息方面起一定的作用,是中枢神经系统控制处理伤害性信息的重要组成部分,同时与内脏调节相关的核团间发生广泛的纤维联系,广泛参与内脏损伤活动的调节。本实验建立了大鼠脑I/R模型,观察大鼠脑组织的病理改变及脑组织不同部位(蓝斑、室旁核、臂旁核、杏仁核)不同时间段NOS、NF-κB的表达,以探讨NOS、NF-κB在脑组织损伤中的调控作用及意义,为脑组织的损伤提供形态学基础,并为建立脑I/R损伤后脑组织的防护性治疗提供实验依据。1材料和方法1.1实验动物中心选用健康Wistar大鼠72只,体重250～300g,雌雄不限(由新疆医科大学实验动物中心提供),置于安静、温暖、避强光的环境中饲养48h。72只大鼠随机分为假手术组、缺血30min组(I组)和缺血30min后再灌注(I/R)0、2、4、6、8、10、12h组共9组,每组8只。1.2戊巴比妥钠液及多聚甲醛液免疫组化试剂盒及NOS、NF-κB一抗购自武汉博士德生物工程有限公司;2%戊巴比妥钠液;4%多聚甲醛液;梯度酒精;蒸馏水。动物试验台,无菌手套,无菌标本瓶,冰箱,电烤箱,光学显微镜,LEICAR2135切片机。1.3免疫组化染色采用Pulsinelli--Brierley方法建立大鼠脑I/R模型,用2%戊巴比妥钠(0.2ml/100g)腹腔内注射麻醉,电凝双侧锥动脉成永久性阻塞;钝性分离双侧颈总动脉,并埋线备用,次日以无损伤动脉夹夹闭双侧颈总动脉,对照组次日不钳夹颈总动脉。I/R0、2、4、6、8、10、12h组,分别于缺血30min终点(再灌注0h)取脑,于脑组织蓝斑、室旁核、臂旁核、杏仁核所在部位做冠状切片,片厚4μm,连取5张,1张作HE染色,其余4张作免疫组化染色。以胞浆和细胞核呈棕黄色为阳性,经图像分析仪处理,每个组织块随机选取1张切片,对照图谱,定位核团,计算该切片特定核团中单视野内NOS、NF-κB阳性细胞数的总和,每组6张取均数。1.4统计处理采用SPSS11.0统计软件包进行统计学处理。各组间NOS、NF-κB阳性细胞数比较采用方差分析,检验水准α=0.05。2结果2.1浸渍剂tpI/R2h组神经细胞肿胀,少量炎性细胞浸润(图1)。I/R8h组脑神经细胞核碎裂、消失,间隙增宽,结构疏松,神经细胞局部溶解、液化性坏死范围较广(图2)。2.2蓝斑nos阳性神经元/胞浆染色结果NOS免疫阳性反应表现为胞浆染成棕黄色或棕黄色颗粒沉积。对照组蓝斑出现少量淡染的圆形或椭圆形神经元,散在分布(图3)。I/R8h组蓝斑NOS阳性神经元数较对照组增加,胞浆着色略加深,有的聚集成团,可见阳性纤维穿行其间(图4)。I/R12h组蓝斑NOS阳性神经元密集,胞体着色深,呈圆形、椭圆形、梭形,有的形成团状(图5)。与对照组相比,I/R2、4、6、8、10、12h组脑组织不同部位NOS表达均明显上调,差异有统计学意义(P均<0.05),NOS8h时表达达高峰,8～12h呈下降趋势(表1)。2.3杏仁核nf-b阳性神经元表达变化NF-κB免疫阳性神经元主要表达为细胞核染成棕黄色或棕黄色颗粒沉积,对照组杏仁核出现核少量淡染圆形、多角形阳性神经元,散在分布(图6)。I/R8h组杏仁核NF-κB阳性神经元数较对照组增加,具有明显突起(图7)。I/R12h组杏仁核NF-κB阳性神经元密集、胞核着色加深,有的形成团块,胞体呈圆形、椭圆形(图8)。NF-κB的表达在各组与对照组组间比较差异有统计学意义(P<0.05),与对照组相比,其余各组脑组织不同部位NF-κB的表达均明显上调,差异有统计学意义(P<0.05),0～8h呈上升趋势,8～12h较稳定(表2)。3讨论3.1nos在损伤早期脑保护作用结果见表1NOS是20世纪80年代后期在生物体内发现和证实,通常以无活性的聚合体存在胞浆中,已确定有神经元型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)和诱导型NOS(iNOS)3种亚型,NOS活性为nNOS、eNOS、iNOS的活性总和。NO具有典型的双重作用,其有利的一面是:激活的NOS在持续时间上nNOS、eNOS是短时调节,在损伤早期脑组织局部nNOS、eNOS合成NO通过以下途径发挥脑保护作用:(1)增加脑血流;(2)抗血栓形成作用;(3)抗血管痉挛作用;(4)抗中性粒细胞粘附反应。其不利的一面是iNOS是持久调节,随着损伤时间的延长其产生的NO加重组织的损伤,iNOS主要被一些细胞因子诱导而激活,催化合成大量的NO参与脑损伤的病理过程,表明NO通过以下途径造成神经元损伤:(1)NO使各种含铁-硫的酶失活;(2)NO通过超氧自由基起细胞毒性作用;(3)NO引起蛋白质的ADP-核糖化;(4)NO可引起多巴胺大量释放;(5)NO可通过介导N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)的而发挥神经毒性作用,在晚期NO可反馈抑制NOS的活性。本实验结果显示,对照组与I、I/R0h组间NOS的表达差异无统计学意义,NOS表达无明显升高,提示脑组织局部nNOS、eNOS合成NO可能发挥了脑保护作用。I/R2h以后各组NOS表达均明显上调,表明iNOS可能被一些细胞因子诱导,催化合成大量的NO参与脑损伤的病理过程,本实验结果提示NO在脑I/R引起脑损伤的调控中起双重作用。3.2b在免疫调节中的作用NF-κB是一种能与免疫球蛋白轻链基因增强子κB序列(GGGACTTTCC)特异性结合的核蛋白,具有传递细胞核内外信息的功能。研究证实,当中枢神经系统发生某些病理改变时,活化的NF-κB在核内以直接或间接的方式诱导与免疫和炎症有关的多种基因的转录而发挥生物学作用,调节机体的病理反应。近年来研究表明,炎症反应在机体I/R损伤中起重要作用,氧自由基和其它信使激活炎性细胞因子和趋化因子的释放是许多炎性疾病发生和发展的主要机制。本实验结果显示,与对