精子顶体蛋白的功能及检测方法

精子顶体蛋白的功能及检测方法

为了预测雄性动物的繁殖能力，传统的精子分析只根据精子浓度、运动强度和形状等参数进行。然而，试验结果表明，这些质量参数有限，不能作为评价仔猪性能的可靠预测值。评价精子功能的试验包括ATP的含量测定,子宫颈黏膜穿过,精子透明带穿过,顶体膜完整性以及顶体蛋白测定等。通常,这些精子功能测试费时或需要特殊的设备,限制了临床和牧场的应用。试验证明,透明带是精子顶体蛋白自然的底物,纯净的顶体蛋白能消化哺乳动物的透明带,此外抗顶体蛋白单克隆抗体能抑制受精。顶体蛋白活性普遍地用作预测受精,而且顶体蛋白活性不能由其他的精液特征值预测。近年来,许多研究优化了精子顶体蛋白测定的方法,这个方法既简便又能预测雄畜繁殖力及估测体外受精率。1确定了“中被确定的算法中,单次被确定基因克隆编码顶体蛋白的基因已经在人、小鼠和大白鼠中被确定。顶体蛋白基因5个外显子被4个内含子中断,顶体蛋白基因被分配到人类的22号染色体、小鼠的15号染色体、大白鼠的7号染色体和猪的15号染色体。2透明带糖蛋白的激活及调节28ku顶体蛋白帮助维持顶体基质的完整性和控制顶体蛋白从顶体反应的细胞中释放。前顶体蛋白只是丝氨酸蛋白水解酶家族的一个成员。前顶体蛋白的主要结构可以划分成3个区域。结构域Ⅰ编码轻链的氨基酸;结构域Ⅱ具有重链的羧基末端区域,这个区域在丝氨酸蛋白水解酶超家族其他成员中不存在。它的独特之处是因为含有高脯氨酸。TopferPetersenE等指出在精子内部前顶体蛋白与顶体蛋白间转化在精子和透明带接触面被调节。一旦前顶体蛋白被激活,随后β-顶体蛋白被释放到细胞外的介质中。前顶体蛋白和β顶体蛋白以同等的亲和力与溶解的透明带糖蛋白(ZPGs)结合。这种结合包括前顶体蛋白/顶体蛋白表面的碱基与ZPGs上聚硫酸盐类的离子键结合。似乎前顶体蛋白/顶体蛋白和这些多聚硫酸盐类的相互作用牵涉到硫酸盐侧链的特异性识别。MorenoRD等指出聚硫酸盐类和ZPGs诱导前顶体蛋白活化,而后它们结合到酶的多聚硫酸盐结合区域。然而,它们也抑制β-顶体蛋白酶的活性。聚硫酸盐结合区域是在分子表面,但不包含活性部位。3公猪顶体蛋白的结构组成所有哺乳动物的卵都是被细胞外基质即透明带包围着,以小鼠为例,ZP是由3个主要的硫酸盐糖蛋白,即mZP1,mZP2,mZP3组成。当前证据表明,在mZP3上O-连接寡糖,组成调节顶体完整的精子结合到透明带表面的主要受体,然而mZP2的功能是作为次级受体固定顶体反应的精子。mZP1被认为具有许多结构角色,前顶体蛋白/顶体蛋白非酶地结合到ZP糖蛋白上,在ZP糖蛋白的聚硫酸盐类和前顶体蛋白基本的残基之间的结合是一个强的离子交互作用。反应物的立体化学结构至关重要,并决定结合亲和力的一个较大范围。公猪顶体蛋白定点诱变和3羧肽酶结构分析确定在结合物中有效的基本残基为2条。前顶体蛋白是一个具有重要作用的多功能蛋白,能维持ZP表面精子顶体反应,使其有足够长时间穿过ZP。然而,结合不必要很坚固,否则会妨碍精子头部穿过ZP。精子部分穿透力来自鞭毛运动,另一部分穿透力来自不明的细胞溶解酶样物的作用,精子头穿过ZP到达卵细胞周隙,第3步结合接着发生,可能与卵膜上的整合素或CD9受体结合。4顶体蛋白活性哺乳动物受精过程中,精子必须通过卵泡的颗粒细胞,穿过透明带,最后和卵母细胞融合一体。受精的精子需要极度活跃才能通过顶体反应释放或暴露可以穿越透明带的顶体蛋白,最终达到配子融合。在精子穿越卵丘细胞与透明带结合时,顶体蛋白起着重要的作用。顶体蛋白最初合成作为前蛋白源,并且被运输到哺乳动物精子顶体中作为无活性酶的形式——前顶体蛋白而存在。除了具有蛋白水解酶的活性,顶体蛋白和它的前顶体蛋白还具有结合透明带上糖蛋白类糖基的能力,还可以利用L-海藻糖和D-甘露糖合成新的糖蛋白。这种酶通过参与透明带的水解,在顶体反应中调节顶体成分的释放,识别同源透明带糖蛋白,包括精卵的交互作用。近年来,结合生化、遗传和实验的有利数据支持这样一种假说,前顶体蛋白是一种多功能的蛋白,对维持透明带表面精子的顶体反应,使其有足够的时间穿过透明带具有重要的意义。顶体蛋白表现两个不同的活性:①酶的活性,如胰蛋白酶样丝氨酸蛋白水解酶;②植物凝血素样碳水化合物结合活性。因此,顶体蛋白被假定具有限制透明带蛋白酶解和维持顶体反应的精子结合到透明带两种功能。另外,顶体蛋白活性对哺乳动物精子与卵膜的融合发育是重要的。几个临床研究表明,在人体外受精处理时,精子的受精潜能,正常形态精子的数量与精子顶体蛋白活性有很强的相关性。现已发现顶体蛋白活性与受精率呈现正相关。FrancavillaS等指出顶体蛋白活性的测定对检测精子的功能病症具有特殊意义。有学者报道,对于临床评价雄性原因不同的不育,总的顶体蛋白活性可以当作灵敏的生物化学的标记。精子顶体蛋白分析能帮助预测精子受精能力。5顶体蛋白的抑制活性在许多临床研究中,顶体蛋白的活性测定已经被应用于人类精液。这些研究结果表明,临床测定能够提供关于精液品质方面有价值的信息。传统上,对顶体蛋白活性的几个测定方法已经应用到实验室,包括放射免疫测定(RIA),应用荧光测定的酶法(FEM)和液化明胶技术。但是这些方法很复杂并耗费时间。后来,检测方法由BlackwellJ等进行了改进。ValdiviaM等报道,应用三抗顶体蛋白单克隆抗体(ACROA8CiO,ACROC2BiO和ACROC5FiO)作为抑制剂来抑制顶体蛋白的活性。现在评估人类精子活性是测定苯甲脒敏感的精氨酸酰胺酶的活性,提出假定全部或几乎所有这种活性都因为顶体蛋白的存在。KennedyWP等报道,他们从来没获得任何证据证明,在人类精子中有其他苯甲脒敏感精氨酸酰胺酶或苯甲脒敏感精氨酸脂酶的存在。其他几个实验也已提出,除了顶体蛋白,还有其他胰岛素样酶与精子有关,但是缺乏有利证据说明。例如,JohnsonRA等报道,公牛精子拥有一种名为水合茚三酮的酶,活性与顶体蛋白相似,通过相同的因子抑制其活性。KennedyWP等指出,没有令人信服的证据证明,除了顶体蛋白精子有其他任何苯甲脒敏感精氨酸酰胺酶,因此他们已经发明一个简单的方法测定人精子全部顶体蛋白活性。这个测定方法包括3个步骤,首先,将人的精液在Ficoll中通过离心的方法除去精清