登革2型病毒prme基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

登革2型病毒prme基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

感染登格病毒（denv）包括四种类型的血液（denv-1、denv-2、denv-3和denv-4），属于黄毒科和黄毒科。DENV感染人体后,可引起登革热(denguefever,DF)和登革出血热(denguehemorrhagicfever,DHF)/登革休克综合症(dengueshocksyndrome,DSS)。根据WHO统计,全世界每年约有5千万～1亿的人感染DENV,其中约近7万的人因感染DENV而死亡,大多是15岁以下的儿童。目前,世界上尚无可有效预防登革热的疫苗和相应的治疗药物。黄病毒的基因组为单股正链RNA,分子量约为11kb。病毒基因组RNA编码核蛋白(capsid,C)、膜蛋白(membrane,prM/M)、包膜蛋白(envelope,E)3种结构蛋白和7种非结构蛋白(NS1,NS2a,NS2b,NS3,NS4a,NS4b,NS5)。其中,prM蛋白在和E蛋白是构成病毒颗粒的主要结构蛋白,在内质网腔中组装成非感染性的未成熟病毒颗粒。在宿主细胞的弗林蛋白酶(furin)的作用下,prM被切割为pr和M蛋白,并引发病毒颗粒表面的E蛋白发生重排,产生含M蛋白的病毒颗粒。黄病毒的包膜E蛋白与prM蛋白在体外表达系统中共表达时,可折叠为类似病毒粒子的正确的空间结构的多聚体颗粒-病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)也称作亚病毒颗粒(subviralparticles,SVPs)。通过cryo-EM分析TBEV病毒样颗粒的分子结构,发现VLPs含有60个E蛋白组成的二聚体,呈二十面体结构,颗粒的直径为30nm左右。Schalich等通过对TBEV的VLP理化特性和生物学活性进行研究后,发现VLPs不仅含有与病毒粒子类似的双层脂膜和E蛋白二聚体的表面排列,而且具有相似的prM和E蛋白的加工和糖基化修饰,甚至连抗原的表位也一致。VLPs同样具有类似成熟病毒颗粒的一些生物学活性方面,如VLPs能在低pH条件下发生结构重排,具有HA活性以及与细胞膜的融合活性等。我们利用组成型表达的毕赤酵母系统表达登革2型病毒的prM和E蛋白,并利用透射电镜技术对病毒样颗粒在酵母细胞内的组装特性进行了初步分析,为研制登革病毒样颗粒疫苗的基础,同时,病毒样颗粒也将为研究登革病毒的组装机制和生物学活性提供一个很好的模型。1材料和方法1.1病毒和细胞株登革2型病毒(DENV-2)ZS01/01株由本实验室分离并测定其全基因组序列,提交GenBank,登录号为EF051521。1.2宿主gs115大肠杆菌(E.Coli)DH5α和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)宿主GS115均由本实验室保存。毕赤酵母表达载体pGAPZαA为Invitrogen公司产品,含组成型表达启动子GAP,酿酒酵母α-factor分泌信号肽编码序列,以及作为选择标记的编码Zeocin抗生素的抗性基因。1.3菌株和抗登革药的制备逆转录酶(ReverseTranscriptase),EXTaq酶和各种限制性内切酶均为大连宝生物工程(Takara)公司产品。TRIzol和Zeocin抗生素为Invitrogen公司的产品。抗登革2型E蛋白的单克隆抗体(3H5-1)购自美国ATCC。鼠源抗登革2型病毒血清由本实验室自制。1.4重组质粒pgaprad-pcr的构建1.4.1引物设计扩增含prM信号肽序列的包膜蛋白基因(SprME)的上游引物为DY1(5′-GACTTCGAAAATGAACATCTTGAACAGGAG-3′),斜体字部分为Bsp119Ⅰ酶切位点,下划线部分代表ATG起始密码子。下游引物为DY2(5′-GAATCTAGATCAGGCCTGCACCATGACTC-3′)斜体字部分为XbaⅠ酶切位点,下划线部分代表终止密码子。所有引物均在PrimerPremier5软件上设计,由广州英骏公司合成。1.4.2登革病毒RNA的抽提与RT-PCR将DENV-2ZS01/01病毒株接种C6/36细胞单层上,加入含2%灭活小牛血清的MEM培养液,于37℃培养至出现细胞病变为“+++”,收集上清进行RNA的制备。RNA的制备的具体方法参照TRIzol抽提试剂盒的说明书。然后以RNA为模板进行RT-PCR扩增目的基因,具体操作步骤为:在一无RNA酶的EP管中加入模板RNA(5～10μg),2μL下游引物(DY2),2μLdNTPs(100mmol/L)和3μLDEPC水,将上述成分混匀并在65℃水浴5min,迅速在冰上预冷2min以上。加入4μL5×PrimeScriptBuffer,1μLRNaseInhibitor(40U/μL),0.5μLReverseTranscriptase(200U/μL)。将上述溶液混匀,在PCR仪上42℃保温30min,70℃15min;然后将PCR管置于冰上冷却,得到的cDNA用于PCR扩增。反应程序为:94℃预变性5min,然后94℃变性1min,55℃退火45s,72℃延伸2min,循环30次,再在72℃延伸10min。1.4.3重组表达载体的构建将获得的目的基因SprM和穿梭质粒pGAPZαA分别用Bsp119I和XbaI进行酶切,并利用E.Z.N.A凝胶回收试剂盒回收所需的基因片段。将酶切回收后的基因片段与pGAPZαA载体在T4DNALigase的作用下进行连接反应。将连接产物转化DH5α感受态细胞。通过含Zeocin抗生素的LowSaltLB平板(25μg/mL)的筛选获得转化的阳性克隆菌落。利用E.N.Z.A质粒抽提试剂盒抽提阳性菌落的质粒DNA进行PCR,酶切和测序鉴定。1.4.4毕赤酵母转化和表达、鉴定利用BglII酶对重组质粒pGAPZA-SprME进行线性化处理,取100μL制备好的毕赤酵母感受态细胞,与10μg线性化的DNA混合,转移到预冷的0.2cm的电转化杯中,冰浴5min,在Bio-Rad电转化仪中进行电击转化,电脉冲参数为电压1500V,5ms。取200μL转化细胞分别铺在含有100μg/mLZeocin的YPD平板上,放置在30℃恒温培养箱中培养2～3d至平板长出乳白的酵母转化菌落。挑取经PCR鉴定为阳性的含有pGAPZA-SprME质粒的酵母菌转化子分别接种于3mLYPD液体培养基(100μg/mLZeocin)中,30℃,250r/min的条件下有氧振荡培养12h。然后按1∶100的比例将菌液接种至100mL新鲜的YPD发酵培养液中,30℃下,振荡培养,每隔12h取出1mL菌液4℃条件下,10000r/min离心,分别收集上清和菌体。取80μL上清与20μL5×上样buffer混合,20μL裂解后的菌体与等量的2×上样buffer混合,在沸水中水浴10min。样品冷却后,进行SDS,每个样品加入两块胶相对应的点样孔。每个点样孔加30μL样品,在120V电压下电泳2h左右。电泳结束后,将一块胶进行考马斯亮蓝染色,相同点样顺序的另一块胶上的蛋白通过电转移至PVDF膜进行Westernblotting检测。膜在含0.1%Tween-20和5%脱脂奶粉的TBS中4℃封闭过夜,然后加入适当稀释的抗E单抗(3H5-1)或者抗DENV-2血清,室温反应4h。用含0.1%Tween-20的TBS洗膜3次,每次10～15min。然后加入1∶2000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG二抗溶液。室温轻轻振荡温育2h。用TBST洗膜3次。最后加入DAB溶液显色。1.4.6病毒样颗粒的纯化取5mL的酵母菌体,加入预冷的1mLBreakingBuffer(50mmol/LNaH2PO4,1mmol/LPMSF,1mmol/LEDTA,5%glycerol,pH7.4)加入酸洗玻璃珠(Sigma)冰浴条件下裂解细胞。裂解液在4℃条件下,12000g离心10min。将裂解液上清移至含5%～50%的蔗糖梯度溶液的上层,在4℃153000g的条件下离心6h(HATICHI,P80AT转子)。离心结束后,取絮状病毒样颗粒层进行电镜检测。1.4.7电镜检测细胞透射电镜观察:将培养72h的酵母发酵液,2000r/min离心5min,收集菌体。小心的加入前固定液,切勿冲散管底的菌体。然后送中山大学电镜室进行包埋,切片等程序,将样品进行电镜观察(PhilipsCM10电子显微镜,工作电压40kV),并拍照。免疫电镜观察:取90μL蔗糖密度梯度离心后的病毒样颗粒,用PBS稀释10倍。加入1∶100稀释的特异性抗DENV-2病毒血清0.1mL充分混合。置37℃作用1h,后再置4℃过夜。以17000r/min,离心60min。吸去上清,将离心管口倒置于滤纸上,吸去残留液体,沉淀物中加少量H2O混悬,用2%磷钨酸(pH7.2)负染1～2min,滴加于400目铜网Fomnvar膜上,用滤纸从铜网边缘轻轻吸去多余的负染液。将样品进行电镜观察(PhilipsCM10电子显微镜,工作电压40kV),并拍照。2结果与分析2.1rt-pcr扩增以DENV-2ZS01/01株病毒的RNΑ为模板,利用下游引物DY2进行RT-PCR扩增得到cDNΑ。然后以cDNΑ为模板用上下游引物DY1/DY2扩增SprME片段,PCR产物的大小约为2250bp,与预期的分子量相符,见图1。2.2pcr鉴定及其扩增将获得的SprME基因片段通过内切酶Bsp119I和XbaI的作用插入pGΑPZαΑ载体的多克隆位点,然后在T4连接酶的作用下进行连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞。经Zeocin抗生素筛选后,进行PCR鉴定,利用载体通用引物5’pGAPFoward/3’AOXI进行扩增,可见一条大小约为2300bp的片段,空载体pGΑPZαΑ扩增出来的片段大小约为530bp(图2A);利用基因特异的上下游引物DY1/DY2检测,可扩增出一条大小约为2250bp的片段,而空载体未扩增出特异性条带(图2B)。最后通过测序表明含prM/E基因的重组表达载体构建成功。2.3denv-2e蛋白检测将重组质粒pGΑPZΑ-SprME电转化毕赤酵母GS115,通过抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,进行发酵表达。收集不同时间段的发酵上清上清分别进行SDS-PΑGE电泳和Westernblot检测。免疫印迹结果显示检测52kDa的蛋白可与DENV-2E单抗特异结合,表明该蛋白就是酵母菌分泌表达的DENV-2E蛋白(图3A);利用抗DENV-2血清孵育后,除检测到52kDa的E蛋白条带外,还在约20kDa的位置检测到prM蛋白带(图3B)。利用凝胶扫描系统分析后发现,E蛋白的分泌表达量占总蛋白含量的23%左右,见图4。2.4空泡病毒样的排列用细胞透射电镜观察表达病毒样颗粒的重组酵母菌超微结构。在酵母细胞的胞浆中形成了一个大双层膜的囊泡结构,大的囊泡中被同样由双层膜结构组成的小室间隔,小室里分布着大量的直径为50-100nm的空泡(vesiclepackets,VP)。在小室里的聚集30-50nm的病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs)以散状或晶格状排列(图5A)。当囊泡的外膜破裂后,那些包裹在小室里面的病毒颗粒便被释放到细胞浆,见图5B。2.5免疫电镜观察经蔗糖密度梯度超速离心后,吸取絮状的病毒样颗粒,进行免疫电镜观察。在抗DENV-2血清的作用下发生聚集,颗粒的形态为规则的球形,直径约为30-50nm,见图6。3denv病毒的分离纯化病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)是指由病毒的一个或多个结构蛋白组装成的,不含病毒核酸,不能进行自主复制的空心颗粒。VLPs不包含病毒DNA或RNA,因此不存在毒力的回复和同源重组的隐患。同时,VLPs保留了与天然病毒粒子相同或类似的空间构型和诱导中和抗体的抗原表位,具有很强的免疫原性。不但能诱导产生体液免疫,而且可以激发CD4+T细胞的增殖和CTL反应。常用的表达VLPs的系统有杆状病毒-昆虫细胞表达系统,酵母表达系统,哺乳动物表达系统和腺病毒表达系统等。其中,酿酒酵母表达系统生产的HBcAgVLPs和四价人乳头状瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)VLPs疫苗已经通过FDA认证。黄病毒样颗粒的形成离不开E蛋白的正确折叠,以及prM和E的相互作用。黄病毒的prM信号肽位于在C蛋白的C末端的疏水的区域,发挥引导prM进入粗面内质网功能。通过对共表达黄病毒的prM和E基因发现,在prM的N端引入prM信号肽能有效的引导E蛋白以VLPs的形式分泌到上清中。我们通过生物信息学软件SingalIP对DENV-2ZS01/01的C蛋白的C末端进行分析后发现,prM的信号肽序列位于C蛋白的C末端的20-25个氨基酸残基序列。并用病毒自身的prM信号肽取代了pGAPZαA载体的α信号肽,实验结果表明在prM信号肽的引导下包膜E蛋白被高水平的分泌表达。用组成型表达的pGAPZαA载体取代传统的甲醇诱导型表达载体是本研究的一大亮点。虽然醇氧化酶(alcoholoxidaseI,AOXI)启动子已被成功应用并表达了多种外源蛋白。但使用甲醇诱导型表达系统存在诸多缺陷,如外源基因的转录水平受到甲醇的严格调控和诱导,残留的甲醇对外源蛋白在食品和药物应用的影响以及发酵培养时不间断的添加甲醇而带来的安全隐患等。因此,相比甲醇诱导型启动子