登革病毒流行株的分离鉴定及毒力检测

登革病毒流行株的分离鉴定及毒力检测

病毒位于黄毒科，分为四种类型（den4型）。引起登格热、登格出血热和登格休克综合征的广泛流行于热带和亚热带地区。登革病毒基因组全长约11kb,只有一个开放读码框架(ORF)。该ORF编码一个聚蛋白前体,经蛋白酶裂解加工成3种结构蛋白(C、PrM和E)和7种非结构蛋白。在3种结构蛋白中,E蛋白为病毒包膜糖蛋白,在病毒感染早期其氨基酸序列决定了病毒对靶细胞的吸附和穿入;决定病毒不同的乳鼠神经毒力。该蛋白的变异可能导致毒力变化,并引起疾病症状的变化。本研究收集广州地区登革热病人的血清,进行病毒的分离与鉴定。并对其中2分离株E基因进行序列测定,分析其基因位点的改变。1材料和方法1.1材料表面1.1.1标准物质采集临床初诊为登革热患者急性期血液,离心分离出血清,-70℃冻存,待用。1.1.2细胞和培养基白蚊伊蚊传代细胞C6/36、Vero细胞(本室保存),营养液用含15%的小牛血清RPMI1640加青,链霉素100U/mL。1.1.3rt-pcr检测1、2、3、4型登革病毒单克隆抗体,羊抗鼠IgG荧光抗体购自鼎国公司。一步法RT-PCR试剂盒为QiaGen公司产品;pGEM-T载体、T4DNA连接酶为Promega公司产品。1.2方法1.2.1分离阴性细胞将病人血清作1∶10稀释,取100μl接种到长成单层C6/36细胞,吸附1h后弃去上清并加入2%维持液,置34℃温箱培养,每代培养7d并观察病变情况,连续传代3次阴性则判断为分离阴性。1.2.2间接免疫荧光检查当感染细胞传代后,在细胞病变达++～+++时收集细胞、点片,37℃烘干,预冷丙酮固定,用登革病毒1、2、3、4型单克隆抗体作为第一抗体,羊抗鼠IgG荧光抗体作为第二抗体,进行间接免疫荧光检查。结果判定:在感染的C6/36细胞浆(胞核周围)中可见绿色荧光颗粒为阳性;阴性、正常细胞染成橘红色。1.2.3病毒毒力分析1.2.3.1.启动大鼠脑取第6代病毒液,脑内接种2d龄乳鼠(约为100pfu/只)。感染后每日观察动物的发病情况。用DEN1标准株(Hawaii株)作对照。1.2.3.强化内培养液制备取第6代病毒液从10-1～10-8进行10倍递增稀释,各取0.2ml接种于单层生长的Vero细胞,37℃吸附1h后,洗去病毒液,加入含1%甲基纤维素,2%小牛血清的RPMI1640培养液1ml/孔。待出现CPE不再发展时,结晶紫染色,计数空斑,计算病毒滴度。1.2.4基因片段的制备利用DNASTAR软件设计引物。取200μL病毒液,用TRIZOL小量提取病毒核酸RNA,一步法RT-PCR扩增E基因片段。反应条件为:50℃逆转录30mim,95℃预变性15min,94℃60s、55℃50s、72℃100s,32个循环后,72℃延伸10min。将扩增产物纯化回收目的片段,与pGEM-T载体连接,转化感受态E.coliDH5α,涂布含氨苄青霉素的LB选择平板,37℃培养后,挑取菌落,进行PCR及酶切鉴定。将阳性克隆委托上海英骏公司进行测序。1.2.5预测及分析方法利用DNASTAR软件包中的PROTEIN程序进行氨基酸序列预测、MEGALIGN程序对两分离株的核苷酸、氨基酸序列与标准株进行比较分析。2结果2.1细胞结构变化共收集91份血清标本,分别接种于C6/36细胞,其中8份标本出现细胞肿胀、堆积融合,并出现空泡、网状结构。病毒分离的阳性率为8.79%。2.2单克隆抗体分型病毒分离阳性的8株病变细胞制成抗原片,经间接免疫荧光法,应用登革1、2、3、4型单克隆抗体分型检查,1型单克隆抗体可将感染登革病毒的C6/36细胞的胞浆染出明显的荧光颗粒,其余型别均为阴性(见图1)。2.3不能吃奶的病用相同剂量的病毒分别感染昆明鼠乳鼠,接种DEN-1/Hawaii的1组小鼠分别于3～4日不能吃奶,进一步发展呈不能直立,有耸背、颤抖等脑炎症状,最终死亡。接种此次分离株的乳鼠组与接种DEN-1/Hawaii株的乳鼠相比,发病的时间较晚,约9～10d才开始出现上述症状,最终死亡。分离株对单层生长的Vero细胞产生噬斑,但所形成的噬斑较小,且不十分透明。2.4蛋白基因序列及序列分析测序结果表明两分离株E基因序列长度均为1485bp,编码495个氨基酸。两分离株之间核苷酸同源性达99.4%,仅有个别碱基的差异。与标准株DV1Hawaii的核苷酸同源性分别为92.5%、92.7%,氨基酸同源性分别为94.3%、96.8%。基因序列未见插入或缺失,核苷酸的差异广泛分布在整个序列中。E蛋白是登革病毒的包膜糖蛋白,登革病毒的毒力基因大多在E区。目前认为登革病毒E蛋白中影响毒力的3个区段是:①Ⅲ区(残基303～395),此区的突变影响病毒进入细胞和细胞嗜性;②Ⅱ区(残基52～136和190～284),此区的改变会影响病毒的促融合活性;③Ⅱ区/Ⅲ区分界面之间的区域(294～305)。两分离株在影响毒力的3个区段中有3处存在变异,E88由Ala→Thr、E297由Met→Val、E339由Thr→Ser。3den-1感染病毒分离登革病毒引起的登革热、登革出血热/登革休克综合征是一种古老的疾病,至今已有200多年的历史。我国自1978年在广东佛山市流行以来,20多年间发生12次流行,其中登革病毒1、2、3、4四个血清型都曾有过流行。1993年佛山市流行过DEN-2型,少数合并DEN-2、DEN-4型感染;1981年番禺流行过DEN-3型;1997年8～11月潮州市暴发登革热流行,证实为DEN-1型感染。本次收集广州地区登革热患者血清91份,共分离到8株病毒,经间接免疫荧光法鉴定为DEN-1型,推测此次广州地区流行登革热为DEN-1型感染引起。病毒分离是流行病学、病原学证据最可靠的方法。本次将91份患者血清接种于C6/36细胞,分离出8株登革病毒,分离的阳性率不高,可能与标本的采集时间、标本处理有关。另外,在实验过程中,也观察到部分血清接种后大片细胞发生萎缩/破碎现象,可能是病人血清对蚊细胞的毒性作用。对于接种血清后大片细胞脱落/破碎的接种孔,补加一些细胞,以提高病毒分离阳性率。由于登革病毒的感染至今没有理想的动物模型,大多数的研究以乳鼠神经毒力及体外标志作为鉴别毒力的依据。此次分离的8株病毒乳鼠脑内接种后发病较晚,感染Vero细