家族性肌萎缩侧索硬化鼠行为学变化的5种评价方法

家族性肌萎缩侧索硬化鼠行为学变化的5种评价方法

肌肉痉挛侧硬化性肌腱（als）是一种成人疾病，选择性伴有着骨髓、树干和皮肤的运动神经元。最后，她死于1.5年前。大约90%的ALS为散发性(SALS),10%的ALS为家族性(FALS),其中约20%的FALS与Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因突变有关。过度表达人类突变的铜-锌超氧化物歧化酶(SOD1-G93A)转基因鼠和人类ALS的临床表现类似,后肢瘫痪大约出现在12周龄,病情逐渐进展,存活时间约为17~20周,目前被广泛应用于ALS新药研发的临床前试验研究当中。因此,找出一种客观、可靠的评价转基因鼠发病和疾病进展的行为学测试方法对于治疗效果的判定极为重要。以前,研究者对于SOD1-G93A转基因鼠行为学的评价主要是采用半定量的方法,像一般状况评分法和足迹分析等。然而,对于药物疗效的评价需要更加客观的测试方法。目前,转棒试验是应用最广泛的行为学定量检测方法,其他一些定量检测方法像平衡试验、悬挂试验和拉力试验都没有得到进一步的推广。因此,为了找出一种能早期且准确的反应SOD1-G93A转基因鼠发病和运动功能变化的行为学检测方法,本实验比较了5种不同的行为学测定方法:一般状况评分法、体重、转棒试验、抓力和步长分析。1材料和方法1.1合子雄鼠与s1d3a模型鼠生长分化实验转人类SOD1-G93A小鼠和同窝非转基因小鼠是由购自于美国Jackson实验室的B6SJL-Tg(SOD1G93A)1Gur/J半合子雄鼠与B6SJLF1雌鼠1∶1杂交繁殖而来(StockNumber:002726),在恒温(22~24℃)、恒湿(40%~60%)、12h光照/黑暗交替循环中饲养。实验在河北医科大学第二医院SPF级实验动物房进行【SYXK(冀)2010-0056】。实验分为两个实验组(n=12,雌性6只,雄性6只):(1)模型组:SOD1-G93A转基因鼠;(2)阴性对照组:同窝非转基因鼠。1.2电子天平hzf-b2b00转棒式疲劳仪(YLS-4C)购于山东医疗科技有限公司;电子天平(HZF-B200)购于福州华志科学仪器有限公司;抓力仪购于美国SanDiegoInstruments。1.3行为评估1.3.1小鼠悬吊过程从第83天开始,参考以往的报道每天进行评分:5分:无运动功能障碍;4分:将小鼠悬吊时出现后肢伸展异常或震颤;3分:明显的后肢无力、步态异常。2分:双后肢完全瘫痪,爬行仅靠前肢;1分:双后肢完全瘫痪,并且将小鼠仰卧后20s内小鼠不能翻转。1.3.2平均体重测定第10周开始记录小鼠体重,从11周开始每周测两次,16周开始每周测三次,最后记录小鼠的平均体重。测量时间选在每天的上午10时到下午1时之间。电子称的称重范围是0.1至200g之间。1.3.3学习阶段测定第10周开始转棒实验,每周测一次,实验前5天为转基因鼠的适应和学习阶段。将小鼠置于静止的转棒仪上,转棒仪从1r/min开始,3min内达到30r/min,记录小鼠在转棒仪上停留的时间。每只小鼠测三次,每次间隔30min,记录停留时间最长的一次。1.3.4金属丝法测小鼠第10周开始进行小鼠后肢抓力测定,每周测一次,抓力感受装置是由平行的金属丝构成的,使其倾斜于地面45°,一手固定小鼠头部,另一手固定其尾部使其后爪抓住金属丝,然后轻拉小鼠尾部,拉力数值从计算机读出,每只小鼠测三次,记录最大的一次。1.3.5小鼠绿色汁的制备第10周开始足迹分析,在一个长50cm宽5cm的跑道里面铺上白色的记录纸,小鼠后爪染上黑色墨汁,使其迅速从跑道的一段跑到另一端。测取3个连续的足迹,记录平均值。1.4统计学处理采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计处理。各组数据用均数±标准误表示。行为学数据使用重复测量设计多因素方差分析进行统计。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1两组患者血清p值的比较第89天时模型组的评分开始下降,第95天时,模型组vs阴性对照组(P=0.069),差异无显著性。第101天时,模型组vs阴性对照组(P=0.000),差异有显著性。从第107天至第137天,两者相比P值均为0.000,差异有显著性(见表1)。2.2模型组和阴性组在第10~14周,模型组的体重与阴性对照组相比,P值分别为0.081、0.092、0.095、0.099和0.101,差异无显著性。第15周时,模型组vs阴性对照组(P=0.026),差异有显著性。第16~18周,模型组与阴性对照组相比,P值分别为0.008、0.000和0.000,差异有显著性(见表2)。2.3模型组和阴性组在第10~12周,模型组的转棒时间与阴性对照组相比,P值分别为0.115、0.114和0.159,差异无显著性。第13周,模型组vs阴性对照组(P=0.047),差异有显著性。第14~18周,与阴性对照组相比,P值分别为0.012、0.004、0.000、0.000和0.000,差异有显著性(见表3)。2.4模型组和阴性组在第10~12周,模型组的抓力与阴性对照组相比,P值分别为0.232、0.399和0.502,无统计学差异。第13周,模型组vs阴性对照组,P=0.000,差异有显著性。第14~18周,与阴性对照组相比,P值分别为0.000、0.000、0.001、0.000和0.000,差异有显著性(见表4)。2.5模型组和阴性组在第10~14周,模型组的后爪步长与阴性对照组相比P值分别为0.857、0.093、0.113、0.526和0.205,差异无显著性。第15周,模型组vs阴性对照组,P=0.000,差异有显著性。第16~18周,与阴性对照组相比,P值分别为0.001、0.000和0.000,差异有显著性(见表5)。3般临床资料检测,主要有以下几种SOD1基因突变是20%家族性肌萎缩侧索硬化的原因,SOD1G93A转基因鼠被广泛用于ALS治疗药物的筛选和观察药物神经保护作用机制的研究,因此,对其进行行为学观察非常重要。最近,Knippenberg等的研究报告显示,转棒试验和足迹分析是检测SOD1-G93A转基因鼠行为学变化最敏感的方法。而Schue562fer和Weydt等的研究结果显示,后肢抓力的测定是最敏感的行为学评价方法。为了进一步证明哪一种方法是最敏感的,本实验比较了5种目前较常用的行为学评价方法。我们参考Vercelli等制定的5分法对SOD1-G93A转基因鼠进行一般状况评估,结果显示,在第89天(13周)时模型组的一般状况评分出现轻微的下降,第101天(14周)模型组和阴性对照组开始有统计学意义,比转棒试验和后爪抓力测定的晚1周。该方法简单易行,然而,其要求观察者必须熟练掌握评分技巧和把握好评分的客观性。体重测定是最客观客观的行为学评价方法,且操作相对简单。由于运动神经元的丢失从而导致肌肉萎缩是SOD1-G93A转基因鼠早期体重下降的主要原因,而在病程的晚期阶段,营养摄入障碍和机体脱水是体重下降的主要原因。结果发现,模型组和阴性对照组相比,从第15周开始有统计学意义,比转棒试验和后爪抓力测定晚2周。然而,第15周时模型组的体重仅出现了轻微的下降,阴性对照组在整个观察过程当中体重呈增加趋势。因此,我们推断阴性对照体重增加是造成第15周出现统计学差异的主要原因。转棒试验是一种相对客观的行为学评价方法。结果显示,在第11周时模型组的转棒时间开始出现下降,比抓力测定晚1周。第13周时模型组与阴性对照组相比开始有统计学意义,与抓力测定一致。转棒试验要求观察者在测定前5d对小鼠进行训练,使其熟练的达到180s,以确保我们测定的转棒时间能够真实的反应小鼠的运动功能。后肢无力是SOD1-G93A转基因鼠的首发症状,因此我们使用抓力仪测定小鼠的后爪抓力。结果显示,模型组的抓力在第10周后开始下降,在第13周开始有统计学差异。尽管抓力测定和转棒试验达到统计学意义的时间是一样的,然而前者检测SOD1-G93A转基因鼠运动动能下降的时间比后者早1周,且操作起来比较方便、省时。此外,抓力测定不需要对小鼠进行提前训练。因此,抓力测定是检测SOD1-G93A转基因鼠发病和运动功能下降的最佳方法,这一结果与Schue562fer和Weydt等的研究结果是一致的。同时,我们对小鼠后爪的步长进行分析。结果发现,第14周后模型组的步长开始变短,15周时有统计学意义,比转棒试验和抓力测