登革病毒结构蛋白与非结构蛋白的表达及疫苗研究进展

登革病毒结构蛋白与非结构蛋白的表达及疫苗研究进展

病毒登甲（d）是黄病毒科的重要成员，通过蚊子传播导致登甲热（df）和登甲出血热（dhf，dnss）。整个重组时间约为10.7脊柱，编码为c-prm-m-e三个结构因素和七个非结构因素。目前通过基因工程技术生产DV各种重组蛋白质已日趋成熟,伴随着对重组蛋白生物学特性的深入研究及动物免疫保护效果分析,使其重组亚单位疫苗的研制有了长足的进步。本文就DV结构蛋白与非结构蛋白在大肠杆菌、杆状病毒、酵母菌和哺乳动物细胞等不同系统中的表达现状及其亚单位疫苗研究进展进行综述。1蛋白非糖基化产物的免疫虽然大肠杆菌(E.coli)无法进行糖基化而影响包膜糖蛋白(Egp)的功能,仍有不少学者以融合表达方式研究E蛋白特性。Mason等通过动物免疫接种产生的抗体证实获得的重组D1VE蛋白具有抗原性。也有学者表达了D2VE298～400aa片段,该蛋白可与DV型特异性抗体免疫结合,并诱生针对D2V的中和抗体,免疫鼠对致死量的同型病毒颅内攻击有部分保护作用。Sugrue等用凝血酶处理表达的E/GST融合蛋白,获得的非糖基化的重组E蛋白具有免疫原性。而Srivastava等将D2V的E蛋白204aa和NS1蛋白65aa以SPA融合蛋白方式表达,抗原性与免疫保护试验中发现该重组蛋白可与型特异性抗体反应,免疫鼠检出有抗D2V抗体,并可抵抗D2V的颅内攻击。2基于dmv的同型病毒病毒感染离子束再生体由于该真核体系能将目的蛋白在合适的细胞区室内表达和正确修饰,因此许多学者应用于DV重组蛋白质的表达及疫苗的研制,而C端截断长度不同的E蛋白是研究热点。Deubel等证实C端截断26aa或71aa的两种重组E蛋白均保留有特异性中和表位。Delenda等试验显示,C端截断102aa和71aa的两种D2VE蛋白的表达及免疫原性相似,其免疫鼠对病毒攻击有一定的保护性。接着作者又比较了C段截断氨基酸数目相同的D2V、D3V两种重组E蛋白的免疫原性,其免疫鼠有DV交叉反应抗体和同型中和抗体;对D2V颅内攻击的保护性,D2VE蛋白组和混合E蛋白组均高于D3VE蛋白组。有学者将金属螯合层析获得的重组截断D2VE蛋白进行动物接种,证实其具有免疫原性,纯化的重组E蛋白诱导的中和抗体及免疫球蛋白类型均相似于灭活的D2V疫苗,并可抵抗同型病毒的攻击。最近Kelly等获得了完整的D2VE蛋白(rEgp)多聚体,试验表明该rEgp具有天然E蛋白相同的结构和功能表位;将纯化的rEgp与铝共同免疫成年鼠,可诱生高滴度的中和抗体,故作者认为该完整的、高免疫原性的重组E蛋白多聚体作亚单位疫苗具有诱人前景。在prM/E蛋白研究领域,Putnak等将D1V的prM107aa与E245aa共同表达,获得的重组蛋白可刺激小鼠产生中和抗体,并能显著降低病毒攻击的死亡率。Bielefeldt-Ohman等分泌表达了D2/D3杂合的重组截断E蛋白(rD2D3E),该蛋白可与一组识别线性或构象表位的DV特异性单抗反应,并与人免疫血清结合。用纯化的rD2D3E接种小鼠,免疫鼠可产生抗D2V和D3V抗体,其水平分别与rD2E或rD3E接种的小鼠相当。也有学者将D2V的全长E蛋白与部分prM、NS1协同表达,得到的重组蛋白可使免疫鼠可产生针对D2V的非中和抗体,其对D2V颅内攻击的保护性较差。在灵长类动物试验中,Eckels等用D4V的C-M-E-NS1-NS2a表达产物免疫恒河猴,可诱生针对NS1的抗体,再用D4V攻击免疫猴时有7/9出现感染,其平均病毒血症时间与对照组猴无差别,表明猴接种重组蛋白后对同型病毒攻击无保护。也有人比较了D2VPDK-53减毒活疫苗、杆病毒表达的重组D2VE蛋白(铝为佐剂)对Macacafassicularis猴的免疫性,发现重组E蛋白与PDK-53活疫苗的免疫有较大差别。非结构蛋白方面,Qu等将发现杆病毒表达的D2VNS1蛋白与白纹伊蚊细胞产生的天然NS1在糖基化、二聚体、细胞呈递和抗原性等方面无区别,用重组蛋白接种的小鼠可产生NS1特异的补体结合抗体,并对病毒的颅内攻击有部分保护作用。3酵母菌dv的免疫反应性酵母菌兼有细菌易于培养、克隆基因筛选方便等优点,又具有真核细胞的加工与修饰作用,因而成为研究真核生命现象的首选工具。Sugrue等实验表明嗜甲醇的毕赤氏酵母菌(Pichiapastoris)中难以形成全长的E蛋白,改为截断E蛋白可稳定表达。接着他将D1V的C-prM-E结构基因用载体PHIL-D2整合转入酵母菌P.pastoris,产生的非分泌型重组E蛋白具有型特异的免疫反应性;透射电镜观察到酵母菌内有球形结构的类病毒颗粒(VLPs)形成,其平均直径约30nm,与DV毒粒相似,动物接种产生的中和抗体表明该VLPs具有免疫原性。近期笔者使用与Sugrue不同的载体成功在P.pastoris分泌表达D2V全长的E蛋白,获得的重组E蛋白有型特异性与免疫反应性,为DV亚单位疫苗的研制提供有利条件。4dv基因重组蛋白及诱导抗体的诱导痘苗病毒作为疫苗宿主具有良好的安全,它可允许不同大小的多种外源性基因的插入并表达。Men等构建了表达D4VE蛋白C端截断长度不同的重组痘苗病毒,小鼠免疫试验显示部分重组的截断E蛋白可诱导中和抗体。Parrish等对重组痘苗病毒研究发现,表达的NS1形成二聚体需部分NS2蛋白的存在和NS1C端的完整性。也有学者在痘苗病毒中同时构建了表达D1V不同基因组的4个重组体,以分析DV表达蛋白的主要免疫原。其中含prM-E或prM-E-NS1-NS2a-NS2b基因的重组体可诱导产生胞外形式的E蛋白,并使免疫鼠产生中和抗体与HI抗体,而另两个不产生胞外E蛋白的重组痘苗病毒不诱导特异的免疫反应,结果表明在痘苗病毒中prM-E共同表达对诱导重组E蛋白分泌及诱导抗体至关重要。鉴于人们对SV40的序列及其复制、表达调控有较为深入的了解,以SV40为载体的哺乳动物细胞表达发展迅速。Pryor等将定点突变的D2VNS1的cDNA克隆插入SV40载体后在COS细胞中短暂表达,以检测变异蛋白是否形成双体、对热敏感性和转染细胞分泌的影响,结果显示NS1二聚体可存在于细胞表面和胞外培养液中,其C末端对双体形成极为重要。5表达方式的制备虽然人们获得了