人教版(2019)高中生物学选择性必修3《生物技术与工程》期末知识点复习提纲详细版(实用-必备!)

第第页人教版（2019）高中生物学选择性必修3《生物技术与工程》期末知识点复习提纲详细版第1章发酵工程第1节传统发酵技术的应用一、发酵与传统发酵技术1．发酵：指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。2．传统发酵技术⑴定义：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术，一般称为传统发酵技术。⑵特点：以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。

⑶实例——腐乳①经过微生物的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸，味道鲜美，易于消化吸收，便于保存。

②参与豆腐发酵的微生物有酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的微生物是毛霉。

二、泡菜的制作1．菌种：附着在蔬菜上的乳酸菌。

①菌种类别：乳酸链球菌和乳酸杆菌。②代谢类型：异养厌氧型。2．制作原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。反应式：C6H12O62C3H6O3（乳酸）+能量。

3．制作流程①配制盐水：用清水和食盐配制质量分数为5%~20%的盐水，并将盐水煮沸，冷却待用。②蔬菜装坛：将新鲜蔬菜洗净，切成块状或条状，混合均匀，晾干后装坛，装至半坛时，放入调味品（如蒜瓣、生姜及其他香辛料），继续装至八成满。③加盐水：将冷却好的盐水缓缓倒入坛中，使盐水没过全部菜料。④封坛发酵：盖好坛盖，向坛盖边沿的水槽中注满水，发酵过程中注意补充水，根据室内温度控制发酵时间。4．泡菜制作过程中乳酸菌数量、乳酸含量和亚硝酸盐含量的变化发酵时期乳酸菌数量乳酸含量亚硝酸盐含量初期少（氧气抑制乳酸菌活动）少增加（硝酸盐还原菌的作用）中期最多（乳酸积累，抑制杂菌活动）增多、pH下降下降（硝酸盐还原菌被抑制，部分亚硝酸盐被分解）后期减少（乳酸继续积累，pH继续下降，抑制自身活动）继续增多，pH继续下降，直至稳定下降至相对稳定（硝酸盐还原菌被完全抑制）变化曲线三、果酒和果醋的制作1．菌种、制作原理与发酵条件⑴菌种的比较比较项目菌种生物类群代谢类型菌种来源果酒制作酵母菌真核生物异养兼性厌氧型主要是附着在葡萄皮上的酵母菌果醋制作醋酸菌原核生物异养需氧型空气中的醋酸菌或人工接种⑵制作原理与发酵条件的比较项目果酒制作果醋制作发酵原理①有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖：C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O；②无氧条件下，酵母菌通过无氧呼吸产生酒精：C6H12O62C2H5OH

+2CO2+能量

①氧气、糖源充足时，醋酸菌将葡萄汁中的葡萄糖分解成乙酸：C6H12O6+2O22CH3COOH+2CO2+2H2O+能量；

②缺少糖源，氧气充足时，醋酸菌直接将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸：C2H5OH+O2CH3COOH+H2O+能量温度发酵温度为18~30℃，酿酒酵母最适生长温度约为28℃

最适生长温度为30~35℃

氧气需求前期需要氧气，后期不需要氧气

需要充足的氧气

时间10~12d7~8d①酵母菌的繁殖需大量能量，而发酵过程进行无氧呼吸，故果酒制作的前期应通入氧气，而后期应保证严格的厌氧环境。②果醋制作过程中要求始终通氧，缺氧时醋酸菌的生长、增殖都会受到影响，另外，醋酸的生成也会受到影响。2．制作流程挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒（→醋酸发酵→果醋）⑴对发酵瓶、纱布、榨汁机、盛葡萄汁的器皿等实验用具进行清洗并消毒。先用温水反复冲洗几次，再用体积分数为75%的酒精擦拭消毒，晾干待用。（消毒的目的是为了防止杂菌污染。）⑵取葡萄500g，去除枝梗和腐烂的子粒。（应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。）⑶用清水冲洗葡萄1～2遍除去污物，注意不要反复多次冲洗。（用清水冲洗的目的是除去污物，不能反复多次冲洗的目的是防止菌种流失。）⑷用榨汁机榨取葡萄汁后，将其装入发酵瓶中或将葡萄打成浆后，用洁净的纱布过滤至发酵瓶中，盖好瓶盖。如果没有合适的发酵装置，可以用500mL的塑料瓶替代，但注入的果汁量不要超过塑料瓶总体积的2/3。（留有1/3空间的目的是留有一定的氧气供酵母菌前期进行有氧呼吸大量繁殖，同时可防止发酵液溢出。）⑸将发酵瓶置于适宜的温度下发酵。⑹由于发酵旺盛期CO2的产量非常大，因此需要及时排气，防止发酵瓶爆裂。如果使用简易的发酵装置，如瓶子（最好选用塑料瓶），每天要拧松瓶盖2～4次，进行排气。⑺10d以后，可以开始进行取样检验工作。例如，可以检验酒味、酒精的含量、进行酵母菌的镜检等工作。⑻当果酒制成以后，可以在发酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后将装置转移至30～35℃的条件下发酵，适时向发酵液中充气。如果找不到醋酸菌菌种或醋曲，可尝试自然接种，但效果不是很好。如果没有充气装置，可以将瓶盖打开，在瓶口盖上纱布，以减少空气中尘土等的污染。⑼果酒的检验：在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。3．实验分析①葡萄酒呈现深红色的原因是红葡萄皮的色素进入发酵液。

②为提高果酒的品质，并能更好地抑制其他微生物的生长，一般工厂生产时采取的措施是直接在果汁中加入人工培养的酵母菌。

③检测果汁发酵后是否有酒精产生，通常用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，发酵液呈现灰绿色。

④结合果酒、果醋的制作原理，请分析此装置中：充气口排气口出料口充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出CO2的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。⑤防止发酵液被污染的措施：榨汁机要清洗干净，并晾干；发酵瓶要清洗干净，用体积分数为70％的酒精消毒；装入葡萄汁后，封闭充气口；发酵装置的排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接。四、几种传统发酵技术微生物代谢特点主要菌种生物类型代谢类型适宜温度发酵对氧的需求腐乳的制作毛霉真核生物异养需氧型15~18℃前期毛霉发酵需氧，后期密封发酵不需氧泡菜的制作乳酸菌原核生物异养厌氧型密闭不需氧果酒的制作酵母菌真核生物异养兼性厌氧型18~30℃前期需氧，后期不需氧果醋的制作醋酸菌原核生物异养需氧型30~35℃一直需氧第2节微生物的培养技术及应用一、培养基1．概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

2．种类：液体培养基和固体培养基，二者的区别为是否添加凝固剂。

培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动、分类、鉴定固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种化学成分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成）分类、鉴定用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（菌落呈黑色，并带有金属光）3．营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。例如：

①在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素。

②在培养霉菌时，需要将培养基调至酸性。

③在培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性。

④在培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件。

4．培养基的应用具体处理原理目的选择培养基加入青霉素青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用分离酵母菌、霉菌等真菌加入10%的酚抑制细菌和放线菌生长分离酵母菌、霉菌不加氮源固氮微生物能利用空气中的氮气，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存分离固氮菌不加有机碳源自养型微生物能利用无机碳源分离自养微生物以尿素为唯一氮源不能利用尿素的微生物因缺乏氮源而不能正常生长，能够分解尿素的微生物能利用尿素作为氮源而正常生长分离尿素分解菌以纤维素为唯一碳源能分解纤维素的微生物具有更多的生存机会而大量繁殖分离纤维素分解菌以石油为唯一碳源不能利用石油的微生物不能生存，能够利用石油的微生物能生存，从而分离出降解石油的微生物分离出能降解石油的微生物加入高浓度的食盐可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存分离金黄色葡萄球菌鉴别培养基加入酚红培养基尿素被分解产生氨，培养基呈碱性，酚红指示剂变红。鉴别分解尿素的细菌加入刚果红刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。鉴别纤维素分解菌二、无菌技术1．获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技术主要包括消毒和灭菌。

⑴消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法、巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体），还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。⑵灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌。比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能2．常用的消毒和灭菌方法比较消毒和灭菌的种类主要方法应用范围消毒煮沸消毒法100℃煮沸5~6min家庭餐具等生活用品巴氏消毒法62~65℃消毒30min或80~90℃处理30s~1min牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体紫外线消毒30W紫外灯照射30min接种室空气化学药物消毒用体积分数为70%~75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等皮肤、伤口、动植物组织表面和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等灭菌湿热灭菌（高压蒸汽灭菌法）100kPa、121℃维持15~30min培养基及多种器材、物品干热灭菌干热灭菌箱160~170℃加热2~3h玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品灼烧灭菌酒精灯火焰灼烧微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等3．几种微生物培养过程中常用器材的灭菌方法： ①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法； ②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。三、酵母菌的纯培养1．相关概念培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。

纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。

纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养。微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。

2．酵母菌的纯培养⑴原理：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。

⑵微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。3．平板划线法⑴平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。⑵方法步骤①制备培养基：配制培养基→灭菌→倒平板。

Ⅰ．

50℃倒平板的原因：a.融化后的培养基温度较高，不经冷却就倒入冷的平板中，则会产生水汽和水滴附着表面壁上，甚至融液的溅出，影响涂布效果。b.培养基温度过高，在倾倒培养液时烫手，同样影响实验的顺利操作。c.培养基的各种成分需要降低温度来稳定，避免导入平板的培养基成分分布不均匀。d.温度太低培养基会凝固，不利于倒平板。Ⅱ．平板冷凝后，要将平板倒置，原因是防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；避免培养基水分过快挥发。Ⅲ．在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板不能用来培养微生物，原因是空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，进而造成污染。

②接种和分离酵母菌：通过接种环（工具）在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。

Ⅰ．将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。Ⅱ．在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。Ⅲ．将试管口通过火焰。Ⅳ．将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。Ⅴ．将试管通过火焰，并塞上棉塞。Ⅵ．左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。Ⅶ．灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。Ⅷ．将平板倒置放入培养箱中培养。③培养酵母菌：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24~48h。

⑶平板划线操作的注意事项①平板划线操作中灼烧接种环的目的项目目的第一次划线前灼烧避免接种环上可能存在的微生物污染菌种第二次及之后每次划线前灼烧杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端划线结束后灼烧及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者②在灼烧接种环之后，要等其冷却再进行划线，以免温度过高杀死菌种。③除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，这样能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。最后一次划线不能和第一次划的线相接触。④划线时用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。四、选择培养基1．自然界中目的菌株筛选的依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

2．实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。

3．选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

4．选择培养基配方的设计（以筛选能分解尿素的细菌的培养基为例）①土壤中尿素被分解的原理：土壤中某些细菌能合成脲酶，其可以催化尿素分解产生NH3，NH3再转化为NO3-、NH4+等被植物吸收②培养基配方：碳源、无机盐、水，以尿素作为唯一的氮源。

五、微生物的选择培养1．方法：稀释涂布平板法。

2．操作步骤①取样。②取10g土样加入90mL无菌水中摇匀，然后依次等比稀释。③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。④涂布⑤平板倒置待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。

3．平板划线法和稀释涂布平板法的比较比较项目平板划线法稀释涂布平板法图示关键操作接种环在固体培养基表面连续划线①一系列的梯度稀释；②涂布平板法操作注意事项每次划线前后均需灼烧接种环稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围菌体获取在具有所需显著菌落特征的区域的菌落中挑取菌体从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体优点可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落既可以获得单细胞菌落，又能对微生物进行计数缺点不能对微生物进行计数操作复杂，需要涂布多个平板六、微生物数量的测定1．几种常见的微生物数量测定方法的比较项目间接计数法（稀释涂布平板法）直接计数法（显微镜计数法）原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌

利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量缺点当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落不能区分细胞死活结果比实际值偏小比实际值偏大2．稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。⑴采用此方法的注意事项：①选择菌落数在30～300的平板上计数。②需培养计算出三个或三个以上的平板菌落求平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。⑵计算公式：每克样品中的菌落数＝（C÷V）×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。⑶设置对照和重复①对照Ⅰ．目的：排除非测试因素对实验结果的影响。Ⅱ．方法：a.空白对照：确定培养基制作是否合格。b.条件对照：用完全培养基与选择培养基对照，说明选择培养基具有选择作用。②重复Ⅰ．目的：排除偶然因素对实验结果的影响。Ⅱ．方法：同一稀释度涂布至少3个平板。七、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数项目内容实验原理a.能合成脲酶的细菌才能分解尿素；

b.配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌

数量统计a.直接计数法（显微镜下用特定细菌计数板或血细胞计数板）；b.稀释涂布平板法实验流程土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→系列稀释→涂布平板与培养→菌落计数1．统计菌落数目一般用稀释涂布平板法。

2．统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落来源于样品稀释液中的1个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数，推测出每克样品中的菌落数。

3．设置重复组，增强实验的说服力与准确性。第3节发酵工程及其应用一、发酵工程的基本环节1．选育菌种：从自然界筛选，也可通过诱变育种或基因工程育种获得；2．扩大培养：使菌体数量快速增长，满足发酵生产的需求；3．培养基的配制4．灭菌5．接种6．发酵——发酵罐内发酵发酵工程的中心环节；随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，及时添加必需营养组分，严格控制温度、PH和溶解氧等发酵条件。7．产品的分离提纯①代谢物：根据产物的性质提取、分离和纯化；②菌体本身：过滤、沉淀等。8．获得产品二、发酵工程的应用1．发酵工程的特点①生产条件温和：温度、压力都不高。②原料来源丰富且价格低廉：微生物种类多，易分离。③产物专一：可直接生产某种物质。

④废弃物对环境的污染小且容易处理：废料是各种代谢产物，只要灭菌后，一般对环境不造成污染。2．发酵工程的应用⑴在食品工业上的应用①生产传统的发酵产品。

如啤酒的工业化生产Ⅰ．发芽：a.主要原料：大麦和水b.作用：释放淀粉酶Ⅱ．焙烤：作用是加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活Ⅲ．碾磨：将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉Ⅳ．糖化：a.设备：糖化罐b.淀粉淀粉酶糖浆Ⅴ．加入啤酒花Ⅵ．蒸煮：作用是产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌Ⅶ．冷却Ⅷ．发酵：a.主发酵阶段：糖酵母菌酒精和二氧化碳b.后发酵阶段：低温、密闭环境储存，使啤酒澄清、成熟Ⅸ．过滤Ⅹ．消毒：作用是杀死啤酒中的大多数生物，延长啤酒的保存期Ⅺ．终止：过滤、调节、分装啤酒进行出售②生产各种各样的食品添加剂。

③生产酶制剂。

⑵在医药工业上的应用①青霉素的发现和产业化生产推动了发酵工程在医药领域的应用和发展。②发酵工程逐步扩展到了其他抗生素、多种氨基酸、激素和免疫调节剂等的生产领域。

⑶在农牧业上的应用①生产微生物肥料。

②生产微生物农药。

③生产微生物饲料。

⑷在其他方面的应用发酵工程正渗透到几乎所有的工农业领域，在助力解决粮食、环境、健康和能源等方面的重大问题上，作出了越来越大的贡献。

第2章细胞工程第1节植物细胞工程一、细胞工程1．操作水平：细胞器、细胞或组织水平。

2．目的：获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品。

二、植物细胞的全能性1．概念：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。

2．原理：细胞内含有本物种的全部遗传信息。

3．全能性表达条件：具有完整的细胞结构，处于离体状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件。

三、植物组织培养技术1．原理：植物细胞一般具有全能性。

2．过程：①外植体：用于植物组织培养的离体的植物器官、组织或细胞。②脱分化：在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞经过脱分化，失去其特有的结构和功能，转变成未分化细胞的过程。

③愈伤组织：高度液泡化，不定形的薄壁组织团块。其细胞的全能性高，分化程度低。

④再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化出根或芽等器官的过程。

3．实例——菊花的组织培养⑴操作流程①外植体的消毒：将流水充分冲洗后的外植体用酒精消毒30s，然后立即用无菌水清洗2~3次；再用次氯酸钠溶液处理30min后，立即用无菌水清洗2~3次。

②外植体的分割：用无菌滤纸吸去表面的水分，用解剖刀将外植体切成0.5~1cm长的小段。③接种：在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3~1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。

④培养：将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18~22℃的培养箱中培养。定期观察和记录愈伤组织的生长情况。

⑤转移培养：将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。

⑥移栽：将试管苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，壮苗后再移栽入土。

⑵注意事项①实验中使用的培养基和所有的器械都要灭菌。接种操作必须在酒精灯火焰旁进行，并且每次使用后的器械都要灭菌。

②接种时注意外植体的方向，不要倒插。

③诱导愈伤组织期间一般不需要光照，在后续的培养过程中，每日需要给予适当时间和强度的光照。

4．植物组织培养的关键①条件：离体，一定营养物质，激素（生长素、细胞分裂素）等。②培养基状态：固体培养基（需再分化生根培养基及生芽培养基）。③体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。④光照的应用脱分化阶段不需要给予光照，再分化阶段需要给予光照，以利于叶绿素的形成。5．植物激素对植物组织培养的影响①按照不同的顺序使用这两类激素，会得到不同的实验结果使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但细胞不分化先使用细胞分裂素，后使用生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率提高②当同时使用这两类激素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向生长素/细胞分裂素植物细胞的发育方向比值高有利于根的分化、抑制芽的形成比值低有利于芽的分化、抑制根的形成比值适中促进愈伤组织的形成四、植物体细胞杂交技术1．概念：将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。

2．原理：体细胞杂交利用了细胞膜的流动性，杂种细胞培育成杂种植株利用了植物细胞的全能性。3．过程①去除细胞壁：酶解法（纤维素酶、果胶酶），获得原生质体②原生质体融合方法：物理法：电融合法、离心法；化学法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+—高pH融合法③细胞融合成功的标志：杂种细胞再生细胞壁

4．植物体细胞杂交中的特点①生殖方式：无性生殖。②遗传物质的变化：经植物体细胞杂交形成的杂种细胞虽然具有两种细胞的遗传物质，但这些遗传物质并不一定都表达，且遗传物质的传递不遵循孟德尔遗传规律。③染色体数的变化：经植物体细胞杂交形成的杂种细胞，染色体数、染色体组数都采用直接相加的方法。若一植物细胞含有2x条染色体，2个染色体组，基因型为Aabb，另一植物细胞含有2y条染色体，2个染色体组，基因型为ccDd，则新植株应为四倍体，其体细胞中染色体数为2x+2y，染色体组数为4，基因型为AabbccDd。5．优点：克服远缘杂交不亲和障碍6．意义：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。7．局限性：不能按照人的要求表达性状“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上长番茄、地下结马铃薯的原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，因此番茄—马铃薯杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，不能像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达。

五、植物繁殖的新途径1．快速繁殖（微型繁殖）⑴概念：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，被人们形象地称为植物的快速繁殖技术，也叫作微型繁殖技术。

【注意】微型繁殖是无性繁殖，进行有丝分裂，其遗传物质不变。⑵特点①无性繁殖，保持优良品种的遗传特性。

②高效、快速地实现种苗的大量繁殖。

③可实现工厂化生产。⑶实例：甘蔗、铁皮石斛等试管苗的生产。2．作物脱毒①选材部位：植物顶端分生区附近（如茎尖）。

②选材原因：病毒极少，甚至无病毒。③操作过程：切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。

④脱毒苗≠抗毒苗脱毒苗是选择植物的分生区如茎尖（刚形成，病毒含量极少，甚至无病毒）进行组织培养而获得的，属于细胞工程的范畴。脱毒苗只是体内不含病毒，不能抵抗病毒的侵染。抗毒苗是把抗某病毒的基因导入受体细胞中，并通过一定的方法培养形成的，属于基因工程的范畴，但转入抗病毒基因的植物细胞也需经植物组织培养才能得到抗病毒的植株。六、作物新品种的培育1．单倍体育种⑴过程eq\x(花药)eq\o(→,\s\up7(离体),\s\do5(培养))eq\x(单倍体植株)eq\o(→,\s\up7(人工诱导),\s\do5(染色体加倍))eq\x(纯合植株)eq\o(→,\s\up7(选择))eq\x(优良品种)⑵优点①当年就能培育出遗传性状相对稳定的纯合二倍体植株，极大地缩短了育种的年限，节约了大量的人力和物力。

②单倍体植株是进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。

2．突变体的利用①产生原因：在植物的组织培养过程中，易受培养条件和诱变因素（如射线、化学物质等）的影响而产生突变。

②利用：筛选出对人们有用的突变体，进而培育成新品种。

七、细胞产物的工厂化生产1．次生代谢物⑴概念：植物代谢产生的一些一般认为不是植物基本生命活动所必需的产物。

⑵本质：一类小分子有机化合物（如酚类、萜类和含氮化合物等）。⑶作用：在植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源。⑶缺点：①植物细胞的次生代谢物含量很低。

②有些产物不能或难以通过化学合成途径得到。

2．细胞产物的工厂化生产①概念：利用植物细胞培养来获得目标产物。

②植物细胞培养：在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术。

③过程④优点：不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制，对于社会、经济、环境保护具有重要意义。

⑤实例：紫草宁、紫杉醇、人参皂苷等的生产。3．植物细胞培养与植物组织培养不完全相同，不需要经过再分化的过程。利用植物细胞培养获得细胞产物只需要通过脱分化得到愈伤组织，然后利用液体培养基大量培养愈伤组织细胞，从中提取所需目标产物。第2节动物细胞工程一、动物细胞培养1．动物细胞工程的技术手段主要有动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等。动物细胞培养是动物细胞工程的基础。2．动物细胞培养的概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。

3．动物细胞培养的条件⑴营养：

培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质，如糖类、氨基酸、无机盐、维生素等，由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此通常需要加入血清等一些天然成分。⑵无菌、无毒的环境：①培养液和培养用具进行灭菌处理；②在无菌环境下进行操作；③定期更换培养液，清除代谢产物。

⑶温度、pH和渗透压①适宜的温度：（36.5±0.5）℃。②适宜的pH：7.2~7.4。③渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。⑷气体环境eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(O2：细胞代谢所必需的,CO2：维持培养液的pH))95%的空气+5%的CO24．动物细胞培养的过程⑴基本过程①细胞贴壁：体外培养的动物细胞大多数往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。②接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖，这种现象称为接触抑制。③原代培养：分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养。④传代培养：分瓶后的细胞培养称为传代培养。⑤进行动物细胞培养时，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞更易于培养，分化程度低的细胞比分化程度高的细胞更易于培养。因为这些细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，所以幼龄动物、分化程度低的组织细胞易培养。⑥进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是蛋白质。⑦动物细胞培养时，要在培养基中加入血清等天然成分的原因是：血清和血浆中含有多种维持细胞正常代谢和生长的物质，如蛋白质、氨基酸、未知的促生长因子等。因此细胞培养时，为保证细胞能顺利生长和繁殖，一般需添加血清、血浆等天然成分。⑧动物细胞培养中的胰蛋白酶处理Ⅰ．用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理组织块，使组织细胞分散开，这样做的目的：①使细胞与培养液充分接触，一方面保证细胞所需氧气和营养的供应，另一方面保证细胞内代谢产物的及时排出；②使在细胞水平操作的其他技术得以实现。Ⅱ．使用胰蛋白酶时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。进行动物细胞培养时不能用胃蛋白酶分散细胞，主要是因为pH不合适。Ⅲ．动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶。第一次使用的目的是使组织细胞分散开；贴壁细胞传代培养时使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。⑵体外培养的动物细胞分类、各自生长和增殖受阻原因和收集方法①一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖Ⅰ．收集方法：离心收集法；Ⅱ．生长和增殖受阻的原因：悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。②大多数细胞需要贴附于某些基质表面（往往贴附于培养瓶的瓶壁上）Ⅰ．收集方法：重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集；Ⅱ．生长和增殖受阻的原因：a.悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。b.接触抑制。二、干细胞培养及其应用1．干细胞的分布与类型⑴存在：早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。⑵类型①胚胎干细胞：存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能；②成体干细胞：成体组织或器官内的干细胞，包括造血干细胞、神经干细胞及精原干细胞，具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。2．诱导多能干细胞①概念：诱导多能干细胞（简称iPS细胞）是通过体外诱导成纤维细胞，获得的类似胚胎干细胞的一类细胞。②应用前景：诱导过程无需破坏胚胎，不涉及伦理问题；iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。因此应用前景优于胚胎干细胞。3．干细胞的应用①有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关，因而在医学上有着广泛的应用。

②胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。

③诱导多能干细胞不涉及伦理问题，理论上可以避免免疫排斥反应。

④部分干细胞的应用举例类型应用优点造血干细胞治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应神经干细胞治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）诱导多能干细胞可治疗小鼠的镰状细胞贫血，在治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展三、动物细胞融合技术1．动物细胞融合原理：细胞膜具有流动性。

2．动物细胞融合的常用方法：PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。

①不灭活的病毒会感染细胞，因而不能用于诱导动物细胞融合。②灭活的病毒是诱导动物细胞融合特有的方法，不能用于诱导植物原生质体融合。3．结果：形成杂交细胞。4．意义：突破了远缘杂交不亲和的障碍。四、单克隆抗体及其应用1．单克隆抗体制备的思路把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。

2．单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高，并可大量制备。3．制备过程⑴给小鼠注射特定抗原的目的是获得能产生相应抗体的B淋巴细胞。

⑵在单克隆抗体制备过程中之所以选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，是因为它们融合后形成的杂交瘤细胞具有既能大量增殖，又能产生特定抗体的特性。

⑶制备单克隆抗体过程中两次筛选的方法及目的项目第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后会得到多种融合细胞，另外还有未融合的细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，因此经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞（“BB”细胞、“瘤瘤”细胞）都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞（“B瘤”细胞）才能生长用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群筛选目的得到杂交瘤细胞得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞⑷单克隆抗体制备过程运用了动物细胞融合和动物细胞培养等动物细胞工程技术。

⑸血清抗体与单克隆抗体名称产生特点血清抗体由浆细胞分泌

一般从血清中分离，产量低、纯度低、特异性差单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌

准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合；能大量制备4．应用①作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。

②用于治疗疾病和运载药物。

5．植物体细胞杂交与动物细胞融合比较植物体细胞杂交动物细胞融合实质内容改变遗传物质、产生新的性状，获得细胞产品（使后代具有双亲的特性）理论基础细胞膜的流动性、植物细胞全能性细胞膜的流动性、细胞增殖诱导手段物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG）物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇生物法：灭活病毒（灭活仙台病毒）过程去细胞壁（纤维素酶、果胶酶）→原生质体融合（获得杂种原生质体）→植物细胞的筛选和培养（获得植株）获得分离的单个动物细胞（胰蛋白酶处理）→诱导融合形成杂交细胞→动物细胞培养（细胞产品）应用白菜—甘蓝等杂种植物单克隆抗体的制备（杂交瘤细胞）意义和用途①克服远缘杂交不亲和的障碍，大大扩展杂交亲本的组合范围；②克服有性杂交的母系遗传的局限性，获得细胞质基因的杂合子，研究细胞质遗传①制备单克隆抗体；②诊断、治疗、预防疾病，如单抗诊断盒、“生物导弹”治疗癌症五、动物细胞核移植技术1．概念：动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。该个体不经过有性生殖过程，其遗传物质与细胞核供体基本相同，叫作克隆动物。

2．理论基础：动物细胞核的全能性。

3．分类及比较：哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。

①动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。原因是动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易；而动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难。

②在动物体细胞核移植中，非人灵长类动物的体细胞核移植非常困难。主要原因一方面是供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低；另一方面是对非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。

4．体细胞核移植的过程以克隆高产奶牛为例：选用去核卵母细胞的原因：卵母细胞比较大，易操作；卵母细胞细胞质多，营养丰富，含有促进核全能性表达的物质。

①核移植中核供体动物、提供卵母细胞的动物、代孕动物和克隆动物之间的关系：克隆动物绝大部分性状与核供体动物相同，少数由线粒体DNA控制的性状与提供卵母细胞的动物相同，与代孕动物的性状无遗传关系。②克隆动物是由重组的细胞经培养而来的，该重组细胞的细胞质基因来源于受体细胞，细胞核基因来源于提供细胞核的供体细胞，其遗传物质来自两个亲本。③动物体细胞核移植技术（克隆）从生殖方式的角度看属于无性生殖。重组细胞相当于受精卵，需要动物细胞培养和胚胎工程技术的支持。5．体细胞核移植技术的应用前景⑴畜牧生产方面：加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。

⑵医药卫生领域①转基因克隆动物作为生物反应器，生产珍贵的医用蛋白。

②转基因克隆动物的细胞、组织和器官可作为异种移植的供体。

③人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的细胞、组织、器官后，可用于组织器官的移植。

⑶了解胚胎发育及衰老过程。⑷用克隆动物做疾病模型，使人们更好地追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病。

⑸保护濒危物种，增加濒危动物的存活数量。

6．体细胞核移植技术存在的问题①体细胞核移植技术的成功率非常低。

②核移植的理论研究较为滞后。③克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷等。

第3节胚胎工程一、胚胎工程的概念1．操作对象：动物生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞。

2．技术手段：体外受精、胚胎移植和胚胎分割等。

3．实质：在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。4．特点：经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。

二、受精1．概念：精子与卵子结合形成合子（即受精卵）的过程。

2．场所：雌性动物的输卵管内。

3．过程①刚采集到的精子还没有受精能力，必须先对精子进行获能处理，才能进一步受精。②刚排出的卵子在受精前也要经历类似精子获能的过程，要在输卵管内进一步成熟，到MⅡ期才具备与精子受精的能力。③防止多精入卵受精的生理反应有：两道屏障，一是透明带反应，二是卵细胞膜反应。防止多精入卵，保证受精卵中遗传物质与亲代体细胞一致，从而保证遗传的稳定性。④精子获能是指精子获得受精“能力”，而不是获得能量。⑤受精的标志≠受精完成的标志：受精的标志是在透明带和卵细胞膜之间观察到两个极体或观察到雌雄原核；而受精完成的标志是雌、雄原核的融合。三、胚胎早期发育1．胚胎早期发育各个阶段①受精卵：受精卵是新生命的第一个细胞，其全能性最高。动物细胞全能性随分化程度的提高而越来越难以表现。②卵裂期：细胞在输卵管内中进行有丝分裂，数量增加，胚胎总体积并不增加或略有减小。③桑椹胚：这个阶段前的每一个细胞都具有发育成完整胚胎的潜能，属于全能细胞。④囊胚：包括内细胞团和滋养层细胞，有囊胚腔。囊胚从透明带中伸展出来称为孵化。囊胚阶段细胞开始出现分化，囊胚阶段的内细胞团细胞具有全能性。内细胞团细胞将来发育成胎儿的各种组织；滋养层则发育为胎儿的胎膜和胎盘。⑤原肠胚：内细胞团表层的细胞形成外胚层，下方的细胞形成内胚层。这时的胚胎称为原肠胚，由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。滋养层则发育为胎儿的胎膜和胎盘。2．卵裂期胚胎发育过程中物质和体积变化的规律①有机物：胚胎没有和母体建立联系，没有从母体获取有机物，而一直进行细胞呼吸，有机物总量减少。②细胞体积：胚胎总体积不增加，但细胞数目增多，所以每个细胞体积减小。③细胞中DNA含量：伴随细胞分裂，细胞数目增多，总DNA含量增多，但每个细胞中核DNA含量保持相对稳定。四、体外受精1．试管动物含义：通过人工操作使卵子在体外受精，经培养发育为早期胚胎后，再进行移植产生的个体。2．体外受精过程⑴主要步骤：卵母细胞的采集、精子的获取和受精等。

⑵体外受精过程①采集到的卵母细胞和精子，要分别在体外进行成熟培养和获能处理，然后才能用于体外受精。

②一般情况下，可以将获能的精子和培养成熟的卵子置于适当的培养液中共同培养一段时间，来促使它们完成受精。

⑶意义①是提高动物繁殖能力的有效措施。

②可以为胚胎移植提供可用的胚胎。3．哺乳动物体外受精过程4．体内受精、人工授精与体外受精的区别与联系项目体内受精人工授精体外受精不同点过程雌雄动物交配完成用人工的方法将公畜的精液注入母畜的生殖道内，完成受精人工获取精子、卵子，在体外培养液中完成受精过程场所雌性动物输卵管中雌性动物输卵管中体外培养液中相同点①精子获能、卵子成熟后方能完成受精过程；②都是有性生殖五、胚胎移植1．概念：将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。2．主要过程①供、受体的选择和处理：使用激素进行同期发情处理、（促性腺激素）超数排卵处理②配种或人工受精③胚胎收集：冲卵（早期胚胎）④检查（胚胎发育到桑椹胚或囊胚）⑤胚胎移植：手术法（引出子宫和卵巢将其注入）；非手术法（用移植管将其送入子宫）⑥移植后的检查（是否妊娠）3．意义：充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。

供体主要职能只是产生优良特性的胚胎，缩短繁殖周期。六、胚胎分割1．胚胎分割：指采用机械方法将早期胚胎切割成2、4或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。2．仪器设备：体视显微镜和显微操作仪、分割针或分割刀3．材料：发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚4．意义：胚胎分割可增加动物后代，来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，属于无性繁殖。5．注意：分割囊胚时要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。此时还可用分割针分割滋养层，做胚胎DNA分析性别鉴定。6．局限：刚出生的动物体重偏低，毛色和斑纹上存在差异，同卵多胎的可能性有限。第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具一、基因工程基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。①操作水平：DNA分子水平②原理：基因重组③优点：Ⅰ.突破物种界限；Ⅱ.定向改造生物的遗传特性二、基因工程的基本工具1．“分子手术刀”——限制性内切核酸酶（限制酶）⑴来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。①原核生物中存在限制酶的意义是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原体的危害。

②限制酶来源于原核生物，其不能切割自己的DNA分子的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

⑵功能：识别双链DNA分子的特定的核苷酸序列，并切开每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（因此具有专一性）⑶作用的化学键：切割磷酸二酯键⑷结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。

如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间；说明限制酶具有专一性。

⑸限制酶的选择①根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类Ⅰ．应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。Ⅱ．不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。Ⅲ．为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（要确保质粒上也有这两种酶的切点）。②根据质粒的特点确定限制酶的种类Ⅰ．所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。Ⅱ．质粒作为载体必须具备标记基因等结构，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。2．“分子缝合针”——DNA连接酶①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，在两个核苷酸之间形成新的磷酸二酯键。②连接的化学键：磷酸二酯键③类型常用类型E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能只“缝合”黏性末端“缝合”黏性末端和平末端结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子

④与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。项目DNA连接酶DNA聚合酶不同点连接的DNA双链单链模板不要模板要模板连接的对象2个DNA片段单个脱氧核苷酸添加到已存在的单链DNA片段上相同点作用实质形成磷酸二酯键化学本质蛋白质⑤DNA连接酶和限制酶的关系⑥限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较名称作用部位作用底物形成产物限制酶磷酸二酯键DNA分子带黏性末端或平末端的DNA片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段重组DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸子代DNA分子DNA（水解）酶磷酸二酯键DNA分子游离的脱氧核苷酸解旋酶碱基对间的氢键DNA分子脱氧核苷酸单链区RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸单链RNA分子3．“分子运输车”——运载体⑴载体的种类①最常用的载体是质粒，它是一种环状DNA分子。②其它载体：噬菌体、动植物病毒⑵载体的作用：将外源DNA片段送入受体细胞中。⑶载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。④对受体细胞无害。三、实验：DNA的粗提取与鉴定1．实验原理①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。

②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。

③在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。

2．实验步骤①材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织。②破碎细胞（以洋葱为例）：洋葱→切碎→加研磨液充分研磨③去除杂质：用纱布过滤→收集滤液→4℃冰箱中旋转几分钟→取上清液④DNA的析出：在上清液中加入体积相等的。预冷的体积分数为95%的酒精溶液静置2~3min→用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起白色丝状物→用滤纸吸去水分⑤DNA的鉴定：将DNA溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，混合均匀后将试管在沸水中加热5min，溶液变成蓝色。第2节基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序主要需要四个步骤：①目的基因的筛选与获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。一、目的基因的筛选与获取1．目的基因的筛选①目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。

②筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。

2．目的基因的获取⑴获取方法：①常用PCR获取和扩增目的基因；②人工合成目的基因；③构建基因文库获取目的。⑵利用PCR获取和扩增目的基因PCR含义在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术目的扩增目的基因PCR原理DNA半保留复制

要求模板目的基因两条链（知道目的基因两端的核苷酸序列）原料4种脱氧核苷酸酶耐高温的DNA聚合酶引物能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸

PCR反应过程变性当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链

复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

延伸当温度上升到72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶从引物3'端开始进行互补链的合成

扩增方向DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3'端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸

方式指数形式扩增（约为2n，n为扩增循环的次数）结果短时间内大量扩增目的基因产物鉴定琼脂糖凝胶电泳二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1．目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

2．基因表达载体的组成基因表达载体的组成包括目的基因、（复制原点）、启动子、终止子和标记基因。①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的上游，RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得所需蛋白质。（诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达）②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的下游，终止转录。③标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。（常见的标记基因有抗生素抗性基因、发光基因（表达产物为带颜色的物质）等。）3．构建过程目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。为了防止载体或目的基因的末端自己连接，即“自身环化”，可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因的两端和载体的切口两端具有两个不同的末端。三、将目的基因导入受体细胞1．转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2．常用的转化方法：生物种类常用方法受体细胞转化过程植物细胞花粉管通道法受精卵用微量注射器将含目的基因的DNA溶液注入子房中；在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊农杆菌转化法体细胞或受精卵将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上→表达动物细胞显微注射法受精卵将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物微生物细胞Ca2+转化法原核细胞Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子①农杆菌转化法原理：农杆菌易感染植物细胞（双子叶植物和裸子植物），其Ti质粒上的T-DNA可转移并整合到受体细胞的染色体DNA上。②受体细胞的选择：受体细胞常用植物受精卵或体细胞（经组织培养）、动物受精卵（一般不用体细胞）、微生物（大肠杆菌、酵母菌）等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素（需内质网、高尔基体的加工、分泌）必须用真核生物，如酵母菌。一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，也没有核糖体等细胞器，不能合成蛋白质。四、目的基因的检测与鉴定1．首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交（DNA—DNA）技术。2．其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用分子杂交（DNA—RNA）技术。3．最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。4．有时还需进行个体生物学水平的鉴定。（如生物抗虫或抗病的鉴定等。）五、生物体内DNA复制与PCR的区别体内DNA复制PCR解旋在解旋酶的作用下，细胞提供能量，双链部分解开加热至90℃以上，双链全部解开，不需要解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链在引物的基础上，以DNA两条链为模板合成子链，其中一条链连续合成，一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成的，控制温度在72℃左右特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增DNA聚合酶需要需要耐高温的DNA聚合酶循环次数受生物体自身控制约30次相同点都需要模板、四种游离的脱氧核苷酸、酶和引物PCR中需要两种引物（分别与DNA的两条链结合），每合成一个子链就需要一个引物。若一个DNA分子扩增n次，则需要引物2n×2-2个。六、实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定1．DNA体外扩增⑴原理：PCR利用了DNA的热变性原理、DNA半保留复制原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。⑵实验步骤①加液：利用微量移液器按照一定的配方，在微量离心管中依次加入各组分；（每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换）②离心：盖严离心管的盖子，放入离心机，离心约10s；③反应：设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液有微量离心管放入PCR仪中进行反应。⑶注意事项：①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。（速溶会破坏缓冲液成分）③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。③在进行操作时，一定要戴好一次性手套。2．DNA片段电泳鉴定⑴原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。①琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质与数量，还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。②DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。③电泳缓冲液类似色素提取的层析液，点样孔通常位于电极的负极端，由于DNA分子在缓冲液中带负电荷，在电场中DNA便向正极端移动，从而分离出大小不同的DNA片段。④凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。⑵实验步骤要根据待分离DNA片段的大小，配制合适的浓度：一般是质量体积比为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。①制备凝胶：Ⅰ融化：用电泳缓冲液配制一定浓度的琼脂糖溶液→沸水浴或微波炉内加热熔化→稍冷却后加入适量的核酸染料混匀；Ⅱ例模：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具→插入大小合适的梳子，以形成加样孔Ⅲ待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子→取出凝胶放入电泳槽内②进行电泳Ⅰ加液：将电泳缓冲液加入电泳槽内，没过凝胶1mm；Ⅱ加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合→用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内；留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物Ⅲ电泳：接通电源，设定电压；待指示剂前沿迁移接近凝胶时，停止电泳；（要根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm）③观察鉴定：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。第3节基因工程的应用一、基因工程在农牧业、医药卫生、食品工业方面的应用分类实例处理或作用在农牧业方面的应用转基因抗虫植物转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯从某些生物中分离出抗虫基因导入作物，使之具有抗虫性状。可减少因化学农药的使用而造成的环境污染和对人类健康的损害，降低生产成本、提高产量

转基因抗病植物转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等将源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入作物，培育出抗病作物转基因抗除草剂植物转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，培育出抗除草剂的作物品种改良植物的品质高赖氨酸玉米、含大量纤维素的转基因玉米、转基因矮牵牛改善植物的营养成分含量（如氨基酸、蛋白质）或提升观赏价值等提高动物的生长速率转生长激素基因的鲤鱼由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长更快，可将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率改善畜产品的品质转肠乳糖酶基因牛将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响在医药卫生领域的应用转基因动物生产药物乳腺生物反应器（乳房生物反应器）将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起转基因动物作器官移植的供体克隆猪器官抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官

在食品工业方面的应用淀粉酶、凝乳酶、天冬氨酸和苯丙氨酸等的生产利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等，如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过③工业发酵生产凝乳酶

①动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。②Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。③青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。④并非所有个体都可作为乳腺生物反应器。操作成功的应该是雌性个体，个体本身的繁殖速度较高，泌乳量、蛋白含量等都是应该