仪器分析第四章高效液相色谱

第四章高效液相色谱1.概述2.HPLC仪器包括：高压输液装置;进样系统;别离系统;检测系统;辅助系统3.流动相和固定相简介4.高效液相色谱方法各论分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱一、概述高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期开展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的根底上开展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送〔最高输送压力可达4.9107Pa〕；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱〔每米塔板数可达几万或几十万〕；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、别离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm,长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径〔3~10m〕！直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及开展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。1.液相色谱别离原理及分类和气相色谱一样，液相色谱别离系统也由两相——固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相〔或在惰性载体外表涂上一层液膜〕、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被别离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行别离。色谱别离的实质是样品分子〔以下称溶质〕与溶剂〔即流动相或洗脱液〕以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保存行为。根据别离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。2.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规那么，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的别离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g,荧光检测器——10-11g。3.HPLC与GC的比较液相色谱所用根本概念：保存值、塔板数、塔板高度、别离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用根本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱根本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差异，主要有以下几方面：a.分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物等，这类物质占有机物总数的80%。b.流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性〞气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的时机多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对别离的奉献很大，可通过溶剂来控制和改进别离。另外，液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。3.HPLC与GC的比较c.操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行，一般有利于色谱别离条件的选择。d.柱外扩展：由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。e.使用本钱：液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。

综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。4.应用由于HPLC别离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。右图是各种HPLC方法的应用范围及对象极性增加不溶于水溶于水非极性离子非离子极性吸附反向分配分配正向分配离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量二、HPLC仪器HPLC仪器包括：高压输液装置;进样系统;别离系统;检测系统;此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。其工作过程如下图。He储液瓶分布器过滤2

m高压泵入口检查出口检查脉流消除抽气过滤器反压调节压力计注样阀分离柱到检测器HPLC仪器详解1.高压输液系统1〕贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2m，可防止颗粒物进行泵内。2〕脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。3〕高压泵：高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成别离过程。对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀，流量精度和重复性为0.5%左右。输液泵种类：恒压型和恒流型。恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力〔主要是柱填充物〕变化而变化，现已较少使用。恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见以下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。马达往复式拉动密封溶剂球阀脉动阻尼器到色谱柱机械往复柱塞泵示意图4〕梯度洗脱：梯度洗脱就是在别离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，到达提高别离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类：一类是外梯度装置〔又称低压梯度〕，流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置〔又称高压梯度〕，将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。如果只有一个泵，可采用低压混合设计〔将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出〕；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最正确平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度〔温度程序〕来到达。2.进样系统与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。1〕隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。2〕高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱3.色谱柱1〕对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)；2〕柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法：即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：当采用粘度较大的试剂，如CC4，CH3OH,丙酮，二氧杂环已烷、THF等。填充方法：填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。4.检测器检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。1〕紫外检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1~10L。HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液波长可的松氟美松皮质酮快速扫描—光电二极管阵列〔PDA〕检测所获得的三维色谱-光谱图2）荧光检测器许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。3）示差折光检测器原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。光源调零光学零参比样品平面镜透镜光电转换记录仪放大器遮光板4〕安培检测器由恒电位仪和一薄层反响池〔体积为1~5L〕组成。如图。该检测器是利用待测物流入反响池时在工作电极外表发生氧化或复原反响，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物质。接参比电极和对电极接色谱柱Teflon塑料块1cm工作电极(Pt,Au,碳糊)5〕电导检测器电导检测器主要用于离子色谱的检测。其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导〔电阻的倒数〕变化来测量电离物质的含量。电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH>7时，该检测器不够灵敏。其它检测器还包括：MS、IR、Evaporativelightscatteringdetector(光散射)、极谱等。三、HPLC流动相和固定相简介〔一〕流动相与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对别离十分重要。理想的溶剂应有以下特性：1〕对待测物具一定极性和选择性；2〕使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长〔所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量〕；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差异，以到达最高灵敏度。3〕高纯度。由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生杂峰〔伪峰〕，同时可使截止波长增加。4〕化学稳定性好；5〕适宜的粘度〔粘度适中〕。假设使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于别离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响别离。〔二〕固定相载体由于各种HPLC别离方法的流动相均为液体，因此，HPLC通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。1.按承受压力分刚性固体：SiO2为基质，耐压为7.0×108~1.0×109Pa。可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于吸附、分配和键合色谱〔在二氧化硅外表键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相〕；硬胶：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成)，耐压上限为3.5×108Pa，主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。2.按孔隙深度分外表多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体外表覆盖一层多孔活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。外表多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小。适于常规别离分析。全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传质快、柱效高。特别适于复杂混合物的别离。3.按别离原理分分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。四、高效液相色谱方法各论按别离原理可将HPLC分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等。现在作分别介绍。〔一〕分配色谱〔液液色谱〕1.原理根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行屡次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现别离的过程。2.流动相HPLC分析中，为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。因此，根据流动相与固定相极性的差异程度，可将液液色谱分为正相分配色谱〔流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分别离〕和反相分配色谱〔流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分别离〕。3.固定相原那么上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撑二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鲨烷(SQ)。根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。1〕机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到外表多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的缺乏是固定液易流失、别离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。2〕化学键合固定相将固定液机械地涂渍在担体上组成固定相。尽管选用与固定液不互溶的溶剂作流动相，但在色谱过程中固定液仍会有微量溶解。以及流动相经过色谱柱的机械冲击，固定相会不断流失，即使将流动相预先用固定相液体饱和或在色谱柱前加一个前置柱，使流动相先通过前置柱，再进入色谱柱，但仍难以完全防止固定液的流失。70年代初开展了一种新型的固定相—化学键合固定相。这种固定相是通过化学反响把各种不同的有机基团键合到硅胶〔载体〕外表的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相。这不仅防止了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了别离的选择性，化学键合色谱适用于别离几乎所有类型的化合物。根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱。在极性键合相色谱中，由于流动相的极性比固定相极性要小，所以极性键合相色谱属于正相色谱。弱极性键合相既可作为正相色谱，也可作为反相色谱。但通常所说的反相色谱系指非极性键合色谱。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。2）化学键合固定相化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格式反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。4.正相和反相键合色谱法

正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比k增加。

5.化学键合固定相的优点〔1〕适用于别离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反响，可以把不同的有机基团键合到硅胶外表上，从而大大提高了别离的选择性；另一方面可以通过改变流动相的组成和种类来有效地别离非极性、极性和离子型化合物。〔2〕由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的别离创造了条件。〔3〕键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。〔4〕固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：A>B>C正、反相色谱中极性和保留时间的关系时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。〔二〕吸附色谱〔液固色谱〕1.原理液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，位于其外表的原子、离子或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些分散的具有外表活性的吸附中心。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行别离，故也称为液固吸附色谱。吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比外表积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保存值；当组分分子结构与吸附剂外表活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。从而使吸附色谱成为别离几何异构体的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族别离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性〔即对分子量的选择性小〕，不能用该法别离分子量不同的化合物。〔二〕吸附色谱〔液固色谱〕2.液固色谱法固定相液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于别离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附剂那么适于别离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。在现代液相色谱中，硅胶不仅作为液固吸附色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。〔二〕吸附色谱〔液固色谱〕3.液-固吸附色谱流动相液相色谱的流动相必须符合以下要求：〔1〕能溶解样品，但不能与样品发生反响。〔2〕与固定相不互溶，也不发生不可逆反响。〔3〕粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。〔4〕应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。〔5〕容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量廉价等。在液-固色谱中，选择流动相的根本原那么是：极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的那么用低极性流动相。

为了获得适宜的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比k值范围很广那么使用梯度洗脱。(三)离子交换色谱离子交换色谱以离子交换树脂为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组别离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组别离子对树脂亲合力不同而得到别离。此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的别离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物别离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。1.原理：利用不同等测离子对固定相的亲和能力〔或离子交换能力〕的差异来实现别离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反响：对阳离子，滞留顺序为：Fe3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Cu2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,UO22+,Tl+,Ag+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+对阴离子，滞留顺序为：柠檬酸根,SO42-,C2O4,I-,HSO4-,NO3-,CrO42-,Br-,SCN-,Cl-,HCOO-,CH3COO-,OH-,F-2.固定相典型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙烯苯交联共聚而成。其中，二乙烯苯起到交联和加牢整个结构的作用，其含量决定了树脂交联度的大小。交联度一般控制在4~16%范围内，高度交联的树脂较硬而且脆，但选择性较好。在基体网状结构上引入各种不同酸碱基团作为可交换的离子基团。按离子交换剂类型分四种：按固定相制作方法可分为〔一般主要这三种形式〕：多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型)〔大孔径网络型树脂〕；外表多孔型(包括薄膜型〕离子交换树脂〔玻璃珠等硬芯子外表涂一层树脂薄层构成的外表层离子交换树脂〕；离子交换键合型〔纯离子交换树脂〕。1）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多——交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型：薄膜型=惰性核+树脂薄层(1-2

m)多孔型=惰性核+硅胶微球+树脂薄层。克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。3）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型离子交换层惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆3.流动相离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定pH和离子强度)，通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、参加有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的别离。pH值：影响酸或碱的离解平衡，控制组别离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，那么不被保存；离子分数越高，保存值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度I：对保存值的影响比pH更大。组分保存值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对—R+或—R-的竞争能力，使组分保存值减小。通过参加不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保存值。其极性越小，保存值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子L：当大量L、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：RM-L+XRM-X+L该法用于别离各种氨基酸或碱类。(四)离子色谱离子色谱(IC)是70年代开展的新方法。其别离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。为解决此问题，1975年Small提出，在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与别离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过别离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，那么发生以下反响：R+—OH+HCl(流动相)——R+—Cl-+H2OR+—OH+MCl(待测物)——R+—Cl+M+OH-可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。该法的缺乏之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低别离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液)作流动相。(五)离子对色谱法〔IPC〕离子色谱对色谱主要用来别离强极性有机酸和有机碱。原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B〔称为对离子或反离子〕参加到流动相中，使待测离子与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保存特性。例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中参加与待测离子A-有相反电荷的离子B+：由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子A1，A2，A3……..因与B离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保