parvalbumin样阳性神经元的触角联系

parvalbumin样阳性神经元的触角联系

1988年，教育办公室首次发现了用于传输三叉神经领域主体感觉的中心通道，包括以下四个四级元素。第一级为三叉神经中脑核(Vme);第二级为由三叉神经脊束核吻侧亚核背内侧部和邻接的网状结构构成的哑铃形核柱(Vodm-LRF);第三级称为“带状区”由背侧的三叉上核尾外侧部(Vsup-CL)和感觉主核背内侧部(Vpam)以及位于腹侧的两个分别存在于三叉神经运动核腹侧和上橄榄核背侧的小核团(前者暂命名为AVM,后者暂命名为ADO)组成;第四级为丘脑腹后内侧核(VPM)。由于此通路长期未被人们所认识,所以此通路核团神经元所含的神经活性物质的性质及分布特点迄今还处于逐渐探索之中。小白蛋白(parvalbumin,PV)是一种常见的钙结合蛋白,广泛分布于中枢神经系统。目前一般认为:它可以通过与作为细胞内第二信使的Ca2+结合,在轴浆运输、细胞代谢和突触传递中发挥重要作用。特别是在中枢神经系统,PV可通过与神经细胞内的Ca2+结合,防止钙依赖的钾离子外流而使膜产生超级化,从而缩短不应期,维持神经细胞的电活动,以保证神经信号快速而准确的传递。由于以上的诸多功能发现,对小白蛋白的研究日益引起人们的关注。本文作者等最近的研究也表明,PV样免疫阳性细胞在三叉神经本体感觉中枢通路各级中继核团中均有较密集的分布,并且在二、三级神经元所在地Vodm-LRF和“带状区”中,大约有30%～50%的PV样阳性神经元为投射神经元。为了进一步了解二、三级中继核团内PV样阳性神经元的形态学特征及与其它神经元、纤维和终末的联系,本研究应用免疫电镜技术观察了大鼠三叉神经本体感觉中枢通路第二、三级神经元所在地内PV样阳性神经元、纤维和终末的分布及其所形成的突触联系,为进一步澄清在面口部本体感觉信息传递和调控过程中PV的作用提供一些形态学依据。抗pv的制备方法雄性SD大鼠6只,体重200～250g。在腹膜腔注射戊巴比妥钠(100mg/kg体重)深麻醉状态下,开胸后经左心室插管,先以100ml0.025mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.3)冲洗血液,再以含4%多聚甲醛、15%饱和苦味酸和0.075%戊二醛的0.1mol/L的磷酸缓冲液(PB,pH7.4)快速灌注固定(20min内完成)。灌毕立即取脑,置于含4%多聚甲醛及15%饱和苦味酸的0.1mol/L的PB内后固定1～2h。振动切片机冠状切脑干,片厚50μm。切片收集于0.1mol/LPB(pH7.4)内。首先将切片置于含25%蔗糖、10%甘油的0.05mol/L的PB(冰晶保护液)中0.5～1h,然后移切片入液氮内进行快速冻融(以增加抗体的渗透性),再将切片移入含20%的正常羊血清的0.05mol/L的Tris-Hcl缓冲液配制的生理盐水(TBS,pH7.4)中孵育0.5h。最后在室温下依次按ABC法进行PV的免疫组织化学反应。具体步骤如下:(1)小鼠抗PV的单克隆抗体(1∶2500,Sigma)孵育切片24h;(2)用生物素标记的驴抗小鼠IgG(1∶100,Jackson)孵育6h;(3)ABC复合物(1∶50,Vector)室温孵育4h。其中一抗、二抗用含2%羊血清的0.05mol/L的TBS稀释;ABC复合物用0.05mol/L的TBS稀释。孵育切片前均用0.05mol/L的TBS洗片三次,每次10min。反应后的切片进行DAB和H2O2呈色。呈色后的切片置入含1%锇酸的0.1mol/L的PB中(pH7.4)后固定45min～1h,1%的醋酸铀染色,梯度酒精脱水,环氧树脂平板包埋,光镜下选择Vodm-LRF及“带状区”(Vpdm、Vsup-CL、AVM及ADO)的部位进行超薄切片,片厚70nm。1%枸橼酸铅染色后,PhilipsCM-100电镜观察并摄片。pv样阳性结构的节流变化在Vodm-LRF区及“带状区”(包括Vpdm、Vsup-CL、ADO、AVM)内均可观察到大量的PV样阳性神经元的树突和轴突终末,偶见PV样阳性胞体。PV样阳性轴突终末内的免疫反应产物主要位于线粒体膜和突触小泡外膜(Figs.A,B);阳性树突内的免疫反应产物位于微管的外膜和微丝的周围(Figs.D,F);阳性胞体内的免疫反应产物主要位于粗面内质网、Golgi器、线粒体膜。PV样阳性胞体较大,多呈圆形或椭圆形;阳性轴突终末内含有均匀分布的突触小泡;阳性树突较多且粗大,树突棘较少。电镜下观察到PV样阳性结构主要形成以下三种突触联系:(1)PV样阳性轴突终末与PV样阳性树突或胞体形成轴-树或轴-体突触,以非对称性为主(Fig.A)。在2张切片的10个铜网上观察到66个轴-树突触,其中非对称性突触在“带状区”为19个,Vodm区为28个,而对称性突触则分别为8个和11个。非对称性突触占此类轴-树突触总数的71%。共观察到30个轴-体突触,其中有23个是非对称性的,占轴-体突触的77%。Vodm区内只观察到2个非对称性的轴-体突触;此类对称性轴-体突触为7个,皆分布在“带状区”内而Vodm区未出现(表1)。(2)PV样阳性轴突终末与PV阴性胞体或树突形成轴-体或轴-树突触联系,以对称性突触为主(Fig.B)。在2张切片的10个铜网上,共观察到27个轴-体突触,50个轴-树突触,其中分别有18个和39个是对称性的,分别占轴-体和轴-树突触的67%和78%(表1)。(3)PV阴性终末与PV样阳性树突或胞体形成以对称性突触为主的轴-树和轴-体突触联系(Figs.C,F),其中轴-树突触的数量最多,在2张切片的10个铜网上,在Vodm区和“带状区”内共观察到369个轴-树突触,其中对称性突触为305个,占83%;而轴-体突触较少,上述两区内只观察到32个,其中对称性突触24个,占此类突触的75%(表1)。另外,不论是在“带状区”还是在Vodm区,均未观察到PV样阳性的突触小球和树突棘结构。pv样阳性轴突与pv阴性胞体或树突形成轴突或为中间神经元的可能联系本研究观察到PV样阳性轴突终末与三叉神经本体感觉中枢通路的二、三级中继核团内的PV样阳性神经元的胞体或树突形成以非对称性为主的轴-体和轴-树突触,其中轴-体突触明显少于轴-树突触。尽管本研究所观察到的PV样阳性轴突终末内由于免疫反应产物的堆积而难以辨认突触小泡的形态,但从大部分PV样阳性结构形成非对称性突触来看,本研究的结果提示在二、三级中继核团内的PV样阳性神经元可能参与面口部本体感觉信息的兴奋性传递。关于PV的作用机制目前还不十分清楚,但一般认为它可能主要是及时地结合去极化时进入细胞膜内的钙离子,防止游离钙离子的增多,因而一方面可以使神经递质释放及时地快速终止,同时也可以对抗钙依赖的K+离子外流而造成的细胞膜超级化,缩短不应期,使神经元能重复快速放电。事实上,有人曾报道:牙周膜受到刺激或咬肌神经受到牵拉刺激时分别能使部分三叉神经中脑核神经元连续放电。因此,在三叉神经本体觉中枢通路的二、三级神经元中PV样阳性结构的存在可能恰好体现了这一功能,使来自咬肌的本体感觉信息既快速又准确的向更高一级中枢传递。本研究还观察到部分PV样阳性轴突与PV阴性胞体或树突形成轴-体或轴-树突触联系,其中对称性突触占70%,非对称性突触为30%。结合本教研室以往的研究结果,在二、三级中继核团内,只有30～50%的PV样阳性神经元为传递本体感觉信息的投射神经元,其余的PV样阳性神经元则可能是中间神经元或投射向其他脑区的神经元。因而有理由推测本研究中所观察到的与PV阴性结构形成突触的PV样阳性轴突可能来自抑制性或兴奋性中间神经元。早在1990年Celio即曾报道,钙结合蛋白不仅存在于长轴突的投射神经元也存在于部分脑区的短轴突神经元,如脊髓背角第Ⅱ层及大脑皮质的中间神经元。罗丕福等也曾观察到在Vpdm、Vsup-CL等核团内存在着大量的GABA能神经元,且这些神经元与含有其他神经活性物质的神经元形成突触联系。另外从Kaneko等报道的磷酸激活的谷氨酰胺酶(phosphate-activatedglutaminase,PAG)在大鼠脑干的分布状况也可观察到在二、三级中继核团所在区域内的部分神经元呈PAG样免疫阳性。根据以往的研究结果,本文作者认为这些存在于二、三级中继核团内的PV阴性胞体或树突可能为GABA能或谷氨酸能的,PV样阳性轴突终末对GABA能或谷氨酸能的中间神经元起到抑制或兴奋作用。既往的许多研究证明:在三叉神经本体感觉中枢通路中,Vodm-LRF和“带状区”的神经元不仅接受谷氨酸能的兴奋性传入,还接受大量的中枢下行抑制系统的5-HT或GABA能神经终末的传入,对其兴奋性活动进行调控。张富兴等的研究也注意到大量的5-HT样阳性终末与Vodm-LRF和“带状区”的投射神经元的胞体和树突形成突触联系。另有些文献也报道:在三叉神经脊束核吻侧亚核和感觉主核内有部分神经元含5-HT受体和GABAA受体,且5-HT和GABA共存于部分中缝核簇的神经元;同时也有文献报道GABAA受体参与面口部本体感觉信息的传递和调控。因此本研究中观察到的大量的PV阴性终末可能是来自中缝核簇的5-HT或GABA能神经终末,它们对于二、三级中继核团内的PV样阳性的投射神经元或中间神经元可能发挥抑制或兴奋作用。综合本研究结果与以往的文献报道可以推测,在二、三级三叉神经本体感觉中继核团内,部分PV样阳性神经元可能是投射神经