高效液相色谱法同时测定附子、附姜、四逆汤水提液中3种生物碱

高效液相色谱法同时测定附子、附姜、四逆汤水提液中3种生物碱

中药附子是毛科植物乌拉的加工产品。它是抗感染药物，用于治疗太阳、转化和转化火、帮助太阳、驱风、净化和恶化疾病。现代研究明确附子中的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双酯型生物碱,既是毒性成分同时也是主要的药效成分,可谓药效与毒性并存。附子经炮制或水解可使其毒性成分降低,转化成一系列毒性较小的成分。但目前附子的炮制尚无标准,部分有效成分会随加工过程流失,因此炮制程度直接关系到附子的减毒、存效。中药配伍是减毒增效又一途径,大量研究证明药物之间相互为伍、协同合作,可能引起药效、化学成分的变化,起到整体增效减毒作用。但目前对附子配伍研究中,仅就其毒性成分的溶出量变化进行研究,还不能有力地解释配伍机制的实质,甚至有些结论是相互矛盾的。附子、干姜配伍是历代医家广为重用的药对,在《伤寒论》回阳救逆之代表方剂四逆汤中就得以很好的体现。古人有“附子无姜不热”、“干姜温中散寒,以其大辛而散毒”之说。《本草纲目》中也有“生姜解半夏、胆南星、乌头、附子及鸟兽肉毒”的记载。所以姜附相配是具减毒、增效双重作用的经典药对。从化学物质基础层面揭示姜附配伍增效减毒机制和规律意义重大。研究以高效液相色谱(HPLC)法同时检测双酯型生物碱,通过比较附姜配伍前后化学成分的变化规律,初步探讨、解释其作用机制,为临床应用提供科学依据。1药物、药品和适应证岛津LC-20AT高效液相色谱仪,岛津SPD-2OA紫外检测器,SIL-2OA自动进样器;SartoriusBT125D分析天平(十万分之一);飞鸽牌离心机AnKeTDL-40B;KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。新乌头碱、乌头碱、次乌头碱对照品由中国药品生物制品检验所提供(批号分别为0799-9403、110720-200410、0798-9403);生附子天津饮片厂提供;干姜、炙甘草由天津中医药大学保康医院提供,经本校中药鉴定教研室张丽娟教授鉴定。甲醇(色谱纯);水为娃哈哈纯净水,其他试剂均为分析纯。2方法和结果2.1流动相、检测波长色谱柱:WaterssymmetryC18柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相:甲醇-0.1%三乙胺(60∶40);检测波长:235nm;柱温:35℃;流速:1.0mL/min;进样量:20μL。2.2溶液的制备2.2.1对照品溶液的制备精密称取新乌头碱13.47mg、乌头碱5.64mg、次乌头碱5.82mg,分别于10mL量瓶中用二氯甲烷溶解并稀释至刻度,即得对照品溶液。2.2.2样品溶液的制备精密称取粉碎后的生附子5g,于250mL圆底烧瓶中,浸泡0.5h,分别用15倍、12倍水;45、30min煎煮2次,离心取上清液,合并,水浴浓缩至30mL,加3倍量95%乙醇搅匀,静置12h滤过,蒸去乙醇,加入10mL稀盐酸,超声15min,至分液漏斗中,分别用30、15、10mL乙醚萃取3次弃去醚液,用浓氨水调pH至9~10,用30、15、10mL二氯甲烷萃取3次,合并萃取液,挥干,再用二氯甲烷溶解至10mL量瓶中稀释至刻度,即得附子样品溶液。2.2.3附姜比例的测定精密称取粉碎后的生附子5g,干姜3g(按药典四逆汤处方附姜比例取样),置于250mL圆底烧瓶中,按照与2.2.2项下相同方法制备即得。2.2.4制备四逆汤方差时g精密称取粉碎后的生附子5g,干姜3g,炙甘草5g(按药典四逆汤处方比例取样)置于250mL圆底烧瓶中,按照与2.2.2项下相同方法制备即得。2.2.5阴性样品的制备按药典四逆汤处方比例取缺附子的阴性样品置于250mL圆底烧瓶中,按照与2.2.2项下相同方法制备即得。2.3稀释液回收率的测定精密量取2.2.1项下的新乌头碱对照品溶液2mL、乌头碱对照品溶液1mL、次乌头碱对照品溶液4mL于10mL量瓶中,用二氯甲烷稀释至刻度混匀,将混合对照品溶液稀释2,4,8,16倍,在上述色谱条件下,按稀释液浓度由低至高顺序进样,测定峰面积。以对照品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,得回归方程(见表1),结果表明在上述范围内线性关系良好。2.4阴性对照液的制备按处方比例称取除附子外其他药味,按2.2.2项下方法制备阴性对照液。在上述色谱条件下检测,结果新乌头碱、乌头碱、次乌头碱出锋处均无干扰,表明方法专属性良好。见图1。2.5峰面积的测定取2.3项下的最低浓度的混合对照品溶液,在以上色谱条件下,重复进样6次,测定峰面积,结果新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD值分别为0.6%、0.6%、0.5%。2.6新乌碱、头皮碱、次麻黄碱峰取同一份附姜样品溶液在1、3、6、12h测定峰面积,结果新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积值相对均数±标准差(RSD)值分别为1.2%、1.4%、1.1%。表明样品溶液在12h稳定性良好。2.8加对照品溶液精密称取已知含量的附子2.5g,干姜1.5g,按2.2.2项下制备,向溶液中精确加入一定量的对照品溶液,测定峰面积计算回收率。新乌头碱,乌头碱,次乌头碱的平均回收率分别为97.1%,98.0%,103.2%,RSD分别为1.6%,1.5%,2.0%(n=6)。2.9外标法计算3种原则将按照附子,附姜,四逆汤制备方法制备的样品溶液在上述色谱条件进样,外标法计算3种生物碱含量及未知峰峰面积(n=3)结果见表2-3,见图2-5。3逆汤中甘草配伍附姜君以养源节工作用本研究中采用生附子为样品,是为了避免炮制品由于水解程度不同造成生物碱含量的差异,以便清晰地观察配伍前后双酯型乌头碱及水解产物变化情况。自古临床使用附子多采用“先煎”、以水煎煮的方式来降低毒性。故提示笔者结合临床用药习惯对其水提液进行研究,以取得对临床用药有指导意义的实验数据。以上实验结果可以看到,煎煮过程中3种双酯型乌头碱中溶出量最高的是次乌头碱,与文献报道一致;姜附配伍水提液较附子中次乌头碱及新乌头碱的溶出量均有显著的增加,其中姜附水提液中次乌头碱增加了135.4%;四逆汤中3种双酯型乌头碱中溶出量较姜附水提液均降低。另外从图3、4、5可观察到X号峰的变化规律,凡有干姜配伍的水提液中面积均增加,在四逆汤中增加尤为显著。初步得出附子配伍增效减毒双重作用机制,附子中双酯型生物碱既是毒性成分又是体现回阳救逆功效的活性成分,与干姜配伍后双酯型生物碱的溶出量大体均增加,体现了中医“附子无姜不热”的观点。其中增加幅度最小的是原本含量最低的乌头碱仅为9.7%,但在四逆汤中毒性最强的乌头碱的溶出量较附子降低约71.0%。所以新乌头碱、次乌头碱含量虽有增加,但是它们的毒性比乌头碱小很多,所以整体还是减毒增效。另外笔者关注的X峰变化规律,在有干姜配伍的水提液中较附子单煎液明显增大,尤其在四逆汤中随着乌头碱溶出量的减少X峰显著增大,而附子空白试液中未检测到此峰。在目前的色谱条件下,本体系中能产生紫外吸收的仅有可能是含有苯甲酰基乌头类生物碱。就此结合参考文献推断,此峰极有可能来自于双酯型生物碱的水解。大量研究表明乌头类双酯型生物碱毒性最大,而当其水解掉一个酯键,变成单酯型生物碱时,毒性降低:水解掉两个酯键时,它的毒性更小,但是这些水解产物却仍具有药理活性。由此推断X号峰所对应的化合物应是使附子配伍增效的关键物质,有待进一步研究。这一推断体现“干姜以其大辛之性而解附子之毒”一说,与药理药效实验研究结果相吻合。这里特别值得提出的是:四逆汤中双酯型生物碱溶出量较附姜配伍减小,X峰较附姜配伍增大,作为佐使药的炙甘草功不可没。有研究表明甘草中的黄酮类化合物与附子中乌头类生物碱等毒性成分结合成不溶于水的物质,而使其配伍后乌头类生物碱明显降低,提示在四逆汤中甘草配伍附姜君臣两药减毒增效作