基于间接竞争酶联免疫法的软海绵酸检测方法的建立

基于间接竞争酶联免疫法的软海绵酸检测方法的建立

大田软海绵酸（oa）是腹泻性贝类毒素（sd）的主要成分。这种海藻来源广泛。它是中国最常见的中毒事件之一，也是最大的破坏因素之一。然而，中国尚未应用于可接近的软海绵酸检测方法。因此，有必要对中国自己的软海绵酸检测方法进行改进。与其他检测方法相比,酶联免疫法具有灵敏度高、特异性好、重复性高和检测准确快速的优点,在现场快速检测上具有开发前景,近年来在赤潮藻毒素快速检测方面得到重视和发展。本实验室在成功制备高效价OA单克隆抗体的基础上,初步建立了检测OA的间接竞争酶免疫学检测方法,为研制具有自主知识产权的相关检测试剂盒奠定了基础。1材料和方法1.1材料和试剂杂交瘤细胞株由本课题组研制和冻存;BALB/c健康小鼠由中国科学院实验动物中心研究所提供。其他试剂国产分析纯。1.2单克隆抗体制备按常规小鼠腹水法制备单克隆抗体。1.3抗原剂2.5mg/l的制备按文献的方法制备。1.4间接竞争检测方法的建立1.4.1抗羊血清学抗体检测在96孔ELISA板上按常规方法进行。检测抗原用包被缓冲液pH9.6,0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释为1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000四个浓度,每浓度做3个重复;OA抗体用含5%牛血清的稀释液稀释成1∶5000、1∶10000∶1∶15000、1∶20000、1∶40000、1∶6000、1∶8000七个浓度梯度;封闭液为1%明胶;酶标二抗羊抗鼠IgG浓度为1∶5000;显色液为TMB;终止液为2mol/LH2SO4。在酶标仪上测定OD450值。1.4.2抗反应时间根据以上试验选取最佳的抗原、抗体稀释度包板,将一抗的保温时间设为30、60、90、120min4组,每组3个平行,二抗反应时间固定为60min。测定OD450值,选择最佳一抗反应时间。固定此最佳的一抗反应时间,将二抗反应时间设为30、60、90、120min4组,每组3个平行,重复以上试验,根据OD450值选择最佳二抗反应时间。1.4.3甲醇对免疫反应的影响一抗和甲醇同时加入,每孔甲醇终浓度设置为0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%等11个浓度梯度,测OD450值。根据OD450值的大小进行判定甲醇对免疫反应的影响。甲醇溶解OA后和一抗同时加入,OA浓度为1∶8000;每孔甲醇的终浓度为20%、30%、40%。另设一组不加OA的作为阴性对照组。测OD450值,计算出抑制率。1.5标准工作曲线的绘制OA终浓度稀释为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.3125ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL13个浓度梯度,按最佳的稀释度和反应时间,用间接竞争ELISA法检测OD450值,以抑制率(P/N)为纵坐标,以log(10×OA浓度)为横坐标绘制标准工作曲线。1.6elisa法提取残余物方法参见(Tagmouti-TalhaF,2000)。将贝类样品洗净、匀浆,称取5g于离心管,加入弱酸性的甲醇溶液,随后加入一定量的OA标准液。3500r/min离心10min,取上清。将上清分装两管,分别加入甲醇和正己烷,涡旋混匀,静止分层。弃正己烷层,在旋转蒸发仪上蒸干,加少量甲醇溶解壁上附着物,再蒸干。最后用100μL甲醇溶解残余物,再加900μLPBST,混匀。提取物进行ELISA检测。OA的实测含量(ng/mL)是根据酶标板上测得OD450值后由标准曲线求得log(10×OA浓度),再通过反对数计算得出。1.7准确度测量取一定量样品,平行提取,同时检测,求得实测浓度。1.8加标回收率a抑制率P/N(%)=(A0-A)/A0×100%(A为吸光值);回收率=实测浓度/添加浓度×100%;精密度=变异系数=SD/X(X为实测浓度的平均值,SD为标准差)。2结果2.1抗体最适工作浓度按试验方法测定OD450值,选OD450值为2.0左右的确定为抗原抗体最适工作浓度。结果显示,检测抗原OA-OVA按1:2000稀释即浓度为1.25μg/L,单抗稀释度为1:20000时,既能保证免疫反应效果好,又使得抗原抗体用量最少。2.2甲醇对aa免疫反应的影响试验结果表明,未加OA时,OD450随着一抗中甲醇浓度的提高而递增,当甲醇终浓度高于10%时,这种递增趋势更明显。当OA与甲醇同时加入时,甲醇浓度的增加会降低OA免疫反应的抑制率(如图1)。因此,样品提取时,为了保证OA全部萃取出来,可先用少量甲醇将其溶解,再用缓冲溶液PBST将甲醇含量稀释到10%以下,而在ELISA检测时,可以直接用PBST稀释OA标准溶液或样品溶液,将甲醇对检测的干扰减少到最低值。2.3抗a间接竞争免疫抑制反应的稳定性从试验结果得知,未加OA时,吸光值OD450会随着抗体反应时间的延长而增加,考虑到要节省检测时间,因而选用抗体反应时间都为60min和90min进行OA间接竞争免疫抑制反应,结果如图2所示,表明一抗和酶标二抗的反应时间均为60min时,其抑制率较高,即抗体对包被抗原结合反应的抑制效果最好。2.4酶标二抗溶液的配制用碳酸盐缓冲液将OA-OVA包被原稀释为1∶2000,包被96孔酶标板,每孔100μL,4℃过夜;弃残液,洗板;用1%明胶封板,每孔150μL,37℃下保温2h;弃封闭液,洗板,用PBST将OA标准溶液或贝类萃取液稀释为系列浓度,分别与等体积的单抗混匀,单抗终稀释度为1∶20000,每孔加入100μL,37℃下保温1h;弃去残液,洗板,加入酶标二抗,按产品说明书推荐的浓度1∶5000进行稀释,每孔100μL,37℃下保温1h;洗板3次,每孔加入100μL显色液,室温下反应10～15min,加入终止液,测OD450值。2.5elisa标准工作曲线试验结果如图抑制率曲线(图3)和标准曲线(图4)。抑制率曲线呈“S”分布。当OA的浓度低于0.3125ng/mL时,抑制率几乎降到0,而高于50ng/mL时,OA对免疫反应的抑制效果几乎一样,因此,OA浓度的有效检测范围在0.3125ng/mL～50ng/mL之间,在此范围内绘制OA间接竞争ELISA标准曲线。标准曲线的回归方程和相关系数分别为y=0.392x-0.054,R2=0.955,有效线性检测范围为0.3125ng/mL～50ng/mL,IC50为2.59ng/mL,检测限为0.45ng/mL。2.6回收率与精密度在OA阴性的贝类样品中分别加入12.5、25、125、500ng/mL的OA标准溶液,提取后用本试验建立的间接竞争ELISA法进行检测,其回收率与精密度结果见表1。此方法平均回收率为55.85%,变异系数为3.03%～8.94%,说明该方法重复性良好,无需在样品检测时做更多平行样。既节约了试剂成本,又节约了人力和时间的消耗。3elisa法检测aa中的灵敏度、限和检测限目前,国内检测OA的方法主要是小鼠法、高效液相色谱法(HPLC)和免疫检测技术(ELISA)。小鼠法简便易行,但缺点是受干扰较大,数据不精确;HPLC法可准确分析毒素的含量和种类,检测限可低至ng/g,但样品前处理过程复杂,仪器昂贵,需要专门人员;ELISA法比HPLC法样品前处理简单得多,特异性好,无需纯化浓缩。另外,ELISA法比HPLC法操作时间短,一次可处理大量样品,而且,ELISA法比HPLC法投资小,适合基层单位使用,因此呈现出了较好的应用前景,受到国内外研究人员的广泛关注。国外多家公司已开发研制出了检测OA的试剂盒,如日本PanapharmLaboratories公司生产的OAELISA检测试剂盒检出限是10ng/mL,美国柏尔BIOO公司也生产出了OAELISA检测试剂盒,但由于价格昂贵,远不适用于我国商检部门的大量应用。近几年国内外均开展了许多关于OA毒素的检测研究,如卢士英,用ELISA法检测OA的线性范围为0.4ng/mL～25ng/mL,而本研究的线性检测范围为0.3125ng/mL～50ng/mL,比其检测范围要广;李爱峰利用蛋白磷酸酶活力抑制法检测OA的最低浓度为0.6ng/mL,TakashiU等建立的ELISA检测腹泻性贝毒方法检出限为10ng/mL,而本研