分子生物学题库整理

分子生物学整理2013/12/10根据每份PPT后的老师给的题目整理的，据说考试不超过那个范围，大家认真复习，若有错误的地方，请积极批评指正！！！第一份PPT分子生物学：是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上正式揭示生物界的奥秘，有被动地适应自然界转为主动地改造和重组自然界的基础学科。生物大分子（biomacromolecule）：主要包括核酸（DNA和RNA）、蛋白质、多糖等，其主要特征是由小分子的构件分子（如：核苷酸、氨基酸、单糖等）组成，具有较复杂的空间结构，而且空间结构与其生物活性密切相关。DNA重组技术（又称基因工程）是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。结构分子生物学：研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的学科。基因组（Genome）：是生物体内遗传信息的集合，是某个特定物种细胞内全部DNA分子的总和。基因组计划（genomeproject）：以获得某物种基因组全序列为主要目标的科学计划。基因组学（genomics）：是指研究基因组结构和功能的科学，包括基因组作图、核苷酸序列测定、基因定位及基因功能分析等。结构基因组学（structuralgenomics）：以全基因组测序为目标，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学（functionalgenomics）：以基因功能鉴定为目标，根据结构基因组学提供的信息，以高通量、大规模的实验方法，借助计算机分析，系统地对基因功能进行诠释。生物信息学是以生物大分子为研究对象，以计算机为工具，运用数学和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈指数级增长的生物信息数据的一门科学。什么是分子生物学？其研究对象是什么？分子生物学：是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。研究对象：生物大分子（biomacromolecule）：主要包括核酸（DNA和RNA）、蛋白质、多糖等，其主要特征是由小分子的构件分子（如：核苷酸、氨基酸、单糖等）组成，具有较复杂的空间结构，而且空间结构与其生物活性密切相关。试举出5例分子生物学发展史上的重要科学事件CharlesDarwin进化论：物竞天择，适者生存施旺细胞学说：动植物都是由细胞组成的。GregorMendel经典遗传学：遗传因子Morgan基因学说Watson和CrickDNA双螺旋模型：里程碑什么是DNA重组技术？有何应用？DNA重组技术（又称基因工程）是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。应用：基础理论研究中的应用基因组测序基因定位基因功能研究基因表达和调控研究多肽类（如激素、抗生素、酶类和抗体等）产品的生产微生物基因工程与多肽类产品的生产转基因动物与蛋白药物的生产转基因植物与蛋白药物的生产转基因动物与人类器官移植物种改良——转基因动植物、工程微生物什么是结构分子生物学？结构分子生物学是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。内容：结构测定、结构运动变化规律探索、结构与功能关系手段：X-射线衍射晶体学（蛋白质晶体学）、二维或多维核磁共振研究液相结构、电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法。第二份PPT分子生物学研究法核酸：是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础(包括DNA与RNA)SDS裂解法：将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁 细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇 沉淀、洗涤质粒DNA。荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA 大得多，电泳迁移率低。紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲 液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。玻棒缠绕法：两个关键步骤，一是基因组DNA沉淀在细胞裂解液和乙醇的交界面；二是将 DNA沉淀缠绕在带钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转移至pH8.0的TE 缓冲液中。压碎与浸泡法：将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱 缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。碱裂解法：在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。（尽 管碱溶液能破坏DNA中的碱基配对，但CCC质粒DNA因缠绕紧密而不易解链，只要不在 碱性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋。）酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法：以含4mmol/L的异硫氰酸胍与0.1mmol/L的β-巯基乙醇 的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的酸性条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通 过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。变性：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏， DNA由双螺旋变成单链过程。增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。融解温度（Tm）：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温 度或融解温度。（爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到 熔点时的融化现象，故名融解温度。狭窄性：变性温度范围很小。）复性：指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象， 它是变性的一种逆转过程。退火：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。核酸分子杂交:两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合 成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。（杂交的本质：就是在一定条件下使 互补核酸链实现复性。）核酸探针：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后 可用特殊方法检测的 已知被标记的核酸分子。cDNA(complementaryDNA)：是指与mRNA互补的DNA分子。固相分子杂交：是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的 杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。原位杂交：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交 并对其检测的方法基因芯片(genechip)：又称DNA芯片（DNAchip）或DNA微阵列（DNAmicroarray），是指 集成了大量DNA片段的玻璃片或纤维膜等载体。问答：简述核酸纯化的原则和要求。原则：保持核酸碱基序列的完整性。尽量清除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度要求：在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。1、温度不要过高(0-4℃)(高温破坏氢键)；2、控制pH值范围(pH4-10)(极端酸碱破坏磷酸二酯键)；3、减少物理因素对核酸的机械剪切力；4、保持一定离子强度。核酸纯度的要求1、核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂；2、其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度；3、排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。说明核酸凝胶电泳技术的原理和要点。原理：一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，带负电荷，在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，迁移率与核酸分子大小成反比。要点：凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。电泳鉴定方法：荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光。为何沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法？改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。简述核酸鉴定的要点。1、核酸浓度鉴定紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。荧光光度法：核酸在嵌入EB后，发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。2、核酸纯度鉴定紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低核酸纯度鉴定3、完整性鉴定琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。A、基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状。B、完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值，如有改变则提示有RNA的降解。C、若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA的污染。什么是酚抽提法？什么是碱裂解法？酚抽提法：以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。裂解液成分的作用：EDTA：离子螯合剂，抑制DNase活性，降低细胞膜稳定性。SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并使其变性沉淀，同时变性DNase。无DNase的RNase：可高效水解RNA而避免DNA的消化。蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白质。酚：变性沉淀蛋白，抑制DNase活性。pH8.0的Tris缓冲液：保证抽提时DNA进入水相，防止DNA变性。碱裂解法：在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA简述RNA提取的要点。RNA极易被RNase水解，除胞内的RNase外，它还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中；RNase分子很难失去活性，而且容易复性，在RNA的制备过程中，排除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步分离总RNA它以含异硫氰酸胍，β-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的条件下，用酚/氯仿抽提细胞裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA什么核酸变性、核酸复性和融解温度？分别受哪些因素影响？核酸变性：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程影响因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。如：加热，极端的pH有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）核酸复性：指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。影响因素：1、温度和时间2、DNA浓度3、DNA分子大小和复杂度4、离子强度融解温度：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度。影响因素：1、DNA分子大小和碱基的组成2、溶液的离子强度3、pH值4、变性剂什么是核酸分子杂交？其本质是什么？核酸分子杂交：两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。本质：在一定条件下使互补核酸链实现复性。什么是核酸探针？有哪些类型？其设计需要遵循哪些原则？核酸探针：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子。类型：基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针探针设计原则：1、探针长度：一般要求在10～50bp。2、G／C含量为40％～60％。3、探针分子中应避免互补序列。4、避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或-CCCC-。5、借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较。10、理想的探针标记物应具有什么特点？检测物要灵敏、特异、稳定、简便。标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值。标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。标记物对检测方法无干扰。简述核酸分子杂交技术的一般流程。探针制备及标记（同位素或非同位素）待测核酸样品制备（分离，纯化）杂交（液相，固相，原位杂交）杂交后处理（去掉非特异杂交分子）显示结果（显色，发光，放射自显影）结果分析有哪些常用的核酸分子杂交技术？其检测对象分别是什么？什么是固相分子杂交？其优点是什么？是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。优点：未杂交的游离探针通过漂洗可容易除去，膜上的杂交分子容易检测，还能防止靶DNA的自我复性，所以被广泛应用。请比较Southern印迹杂交和Northern印迹杂交的相同点和不同点。相同点：杂交流程相同，探针种类和标记方法相同，检测方法相同不同点：Southern印迹是与酶切后的电泳DNA片段杂交，Northern印迹杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的一种膜上印迹技术。什么是原位杂交？其特点是什么？原位杂交：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。特点：原位杂交技术除了具有核酸分子杂交的特异性高的特点之外，并可精确定位，如何进行核酸分子杂交条件的优化？1、探针的选择检测单个碱基改变选用寡核苷酸探针。检测单链靶序列选用与其互补的DNA单链探针或RNA探针。长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体。100bp左右的探针适合原位杂交。2、探针的标记方法在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和价廉的HRP显示系统等。探针的浓度随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加4、杂交最适温度若反应温度低于Tm10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。一般情况下，在不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在65℃进行，当含50%甲酰胺时，在42℃进行。反应时间和洗膜温度杂交时间短了，反应无法完成；长了引起非特异结合增多。一般杂交20h左右。杂交后的最终洗膜温度一般应低于Tm值5~12℃进行。什么是基因芯片？其突出特点是什么？有何应用？基因芯片(genechip)：又称DNA芯片（DNAchip）或DNA微阵列（DNAmicroarray），是指集成了大量DNA片段的玻璃片或纤维膜等载体。突出特点：建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段应用：基因表达水平的检测基因突变和多态性的检测基因芯片在药物筛选中的应用预防医学领域的应用基因芯片在疾病诊断中的应用第三份PPT名词解释：one-stepRT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、TaqDNA聚合酶、PCR引物、dNTP和缓冲液，直接以mRNA

为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法RT-PCR荧光定量PCR：是通过对PCR扩增反应每个循环结束时产物荧光信号的检测，对起始模板 进行定量分析的技术。实时荧光定量PCR:是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光阈值：CR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是 3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的 域值时所经历的循环数。PCR-限制性酶切片段多态性（PCR-RFLP）：不同的限制性核酸内切酶能识别特异的DNA序 列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大 小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息。（用途：传染病病原体 基因分型、人类基因变异研究。）单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）：本法就是将PCR产物双链DNA（dsDNA）变性为 单链DNA（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA分子在凝胶 中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此， 电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。PCR-ELISA：引物采用双标记，即一个引物5’端标记便于PCR产物固定的功能基团（如生 物素），另一个引物5’端标记便于PCR产物检测的基团（如地高辛、荧光素等）。非特异性扩增：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特 异性扩增带与非特异性扩增带。荧光染料法：SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入链中的 SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加 完全同步。复合探针法（complexprobes）基本原理：首先合成两个探针，一是荧光探针（25bp），5′端 接一荧光分子，另一为淬灭探针（15bp），3′端接一淬灭分子，淬灭探针能与荧光探针 5′端杂交。问答:简述聚合酶链反应（PCR）的原理和反应体系。原理：模拟体内DNA半保留复制过程，在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应，由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。反应体系：模板（template）引物（primer）DNA聚合酶（DNApolymerase）dNTPPCRbufferPCR引物的设计需要遵循哪些原则？1、长度15～30b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。2、引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45～55%左右。3、引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构；两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体4、物的碱基顺序与非扩增区域同源性小于70%或连续互补碱基少于8个。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。5、引物的3′末端与模板DNA一定要配对。另外3′末端的末位碱基最好选T、G、C，而不选A（引物3′末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异）。6、只要与模板DNA结合的引物长度足够，引物的5′末端碱基最多可以有10个碱基不与模板DNA匹配，并不影响PCR反应进行。简述PCR的一般方案。1、50ulPCR反应体系的组成样品DNA0.1～1ug；正链引物（25umol/L）1.0ul；负链引物（25umol/L）1.0ul；dNTP（各2.5mmol/L）4.0ul；10×PCR缓冲液5.0ul；MgCl2（25mmol/L）3.0ul；TaqDNA聚合酶1～2.5u；蒸馏的去离子水补至50ul。2、对照：阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。3、PCR仪工作参数的设置：94℃30～60sec，55℃30～60sec，72℃30～60sec，循环30次，最后72℃延伸5min。4、PCR产物的保存：PCR产物于4℃保存。请分别说明假阳性、非特异性扩增、假阴性、引物二聚体、无扩增产物、拖尾等现象出现的原因及应采取的对策。假阳性原因：①PCR产物是最主要的污染源。②含有靶DNA序列的质粒的污染。③阳性对照的污染。④标本之间的交叉污染。⑤在采集标本时，其他污染源带来的污染。⑥Taq聚合酶中带有细菌DNA，当PCR扩增片段为保守的rRNA序列时,易造成假阳性对策：1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。非特异性扩增原因：1、引物特异性差2、模板或引物浓度过高3、酶量过多4、Mg2+浓度偏高5、退火温度偏低6、循环次数过多对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR2、适当降低模板或引物浓度3、适当减少酶量4、降低镁离子浓度5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法6、减少循环次数假阴性原因：1、标本处理的原因①处理标本时，靶DNA丢失。②处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。③标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA）2）PCR试剂问题①TaqDNA聚合酶失活。②Mg2+浓度过低或是没有加。3）PCR扩增过程中的问题①PCR扩增仪故障。②PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。4）PCR产物鉴定中的问题①电泳时没有加溴化乙锭。②电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。③凝胶浓度过低，使扩增带跑散。对策：依原因，自己总结引物二聚体的原因有：1、两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3′端有互补区。2、引物模板比例太高，可增加模板用量。3、退火温度过低。4、热循环次数过多。对策：增加模板用量。提高退火温度。减少热循环次数。减少引物3′端有互补区碱基配对无扩增产物的原因：模板含有抑制物，含量低。Buffer对样品不合适。引物设计不当或者发生降解。退火温度太高，延伸时间太短。对策：纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量。更换Buffer或调整浓度。降低退火温度、延长延伸时间。重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物。拖尾产生原因：模板不纯、Buffer不合适、退火温度偏低、酶量过多、dNTP、Mg2+浓度偏高、循环次数过多对策：纯化模板、更换Buffer、适当提高退火温度、适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度、减少循环次数简述荧光定量PCR的原理和定量方法。原理：基于荧光能量传递技术，通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用，能量从供体发色基团转移到受体发色团，转移效率与两个发色团之间距离的6次幂倒数成比例，受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比，检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度。定量方法：荧光染料法，荧光探针法6、荧光定量PCR有哪些类型？荧光染料法、荧光探针法、Taqman技术、LightCycler探针技术、molecularBeacon技术、复合探针法名词解释：基因工程:是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表 达的技术。分子克隆：是指将目的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、 扩增，以获得该DNA分子大量拷贝的技术限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。回文结构：指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）。粘性末端：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。平末端：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。同工异源酶：指来源不同，但能识别和切割同一位点的酶。同尾酶：指识别序列不同，但能产生相同粘性末端的酶。载体：指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。克隆载体：能将载体外源DNA在受体细胞中复制、扩增并产生足够量目的DNA的载体多克隆位点：载体上具有的多个限制酶的单一酶切位点表达载体：指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。报告基因：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因， 又称报道基因基因组文库：是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群感受态细胞：细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞转化：是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程问答：Klenow片段、Taq酶、逆转录酶、末端转移酶和DNA连接酶分别有哪些作用？Klenow片段：补齐双链DNA的3末端，同时可使3末端DNA标记上同位素。cDNA克隆中，合成cDNA第二链。DNA序列分析。Taq酶：具有5→3聚合酶活性和依赖于聚合作用的5→3外切酶活性。可用于DNA测序及通过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增。逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，逆转录酶是多功能酶。①RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）②核糖核酸酶H活性（RNaseH）③DNA聚合酶活性（DDDP）末端转移酶：在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3末端-OH上。功能主要有：1、在载体或目的基因3末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。2、用于DNA3末端的同位素探针标记。DNA连接酶：催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5磷酸基团与3羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来克隆载体应具备什么特征？能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般<10Kb。带有遗传筛选标记。有适当的限制酶酶切位点，便于外源DNA的插入和筛选。请比较pBR322载体、pUC系列载体、噬菌体载体、M13噬菌体载体和粘粒载体的结构特征和用途。pBR322载体和pUC系列载体的用途：①用于保存和扩增<2Kb目的DNA。②构建cDNA文库。③目的DNA的测序。④作为核酸杂交时的探针来源。pBR322载体：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb。含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点（Ori），并装有四环素抗性（Tetr）基因和氨苄青霉素抗性（Ampr）基因供菌落筛选。两个抗性基因中分别含有BamHI和PstI等限制酶的单一酶切位点，用于插入外源DNA片段pUC系列载体：由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的双链DNA质粒载体。多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。含Ampr，可供菌落筛选。载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因序列中含有多克隆位点。噬菌体载体：λ噬菌体载体：全长约48.5Kb，其中60%（约30Kb）是溶菌生长所必需，中间40%的区域为非必需，可被外源DNA片段代替而不影响λ噬菌体的生存。5末端含12核苷酸的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称为cos位点，λ噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状DNA分子用途：①用作一般的克隆载体。②用于构建基因组或cDNA文库（<22Kb）。③用于抗体库或随机肽库的构建。④核酸的序列分析。M13噬菌体：为6.4Kb左右的闭环正链DNA分子。克隆的外源基因片段<1kb。M13中引入的多克隆位点，正好插入LacZ基因内，可利用蓝白色噬菌斑筛选重组体。粘粒克隆载体：由质粒和λ噬菌体的cos位点构建而成。组成：质粒复制的起始位点(Ori)。携带抗药基因。用于插入目的基因的单一酶切位点。噬菌体的cos位点。特点：粘粒载体大小为4～6Kb，而插入外源基因长达40～50kb。加入λ噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于λ噬菌体的具感染能力的颗粒，容易进入大肠杆菌。粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而表现质粒的特性。用途：①克隆大片段DNA。②构建基因组文库。简述大肠杆菌表达载体的结构。在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：启动子—核糖体结合位点—转录终止信号。简述基因工程的基本步骤。目的基因的获取载体的选择目的基因和载体的连接重组DNA导入受体细胞重组体的筛选和鉴定目的基因的获取有哪些途径？1）从基因文库中获取2）逆转录合成cDNA3）人工合成DNA片段4）直接从染色体DNA中分离目的基因7、有哪些目的基因和载体连接的方法？1)粘性末端连接：本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点。2)平末端连接：质粒和目的基因上没有相同的酶切位点3）人工接头：本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点4）通过同聚尾连接：本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点8、有哪些制备感受态细胞的方法？CaCl2处理，增加大肠杆菌细胞膜通透性。电击法，高压脉冲使细胞膜形成暂时性微孔。简述双抗生素筛选法和蓝白斑筛选法的原理。双抗生素筛选法：某些质粒载体如pBR322质粒中有Ampr和Tetr抗性基因，在这两个基因中装有几个常用的MCS，如将外源DNA片段插入BamHⅠ识别序列时，则此质粒由Tetr变为对四环素敏感（Tets）。这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素筛选法蓝白斑筛选法：某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码β-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸α-肽的DNA片段，IPTG可诱导此片段合成,此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内ɑ-互补，形成完整的β-半乳糖苷酶，催化指示剂底物X-gal形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。当外源基因插入lacZ基因中MCS，lacɑ-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无β-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选法。重组体的筛选和鉴定分别有哪些方法？重组体的筛选根据载体的抗药性标志筛选根据载体抗药性标志插入失活选择β-半乳糖苷酶基因失活筛选（蓝白斑筛选法）根据插入的外源性基因的性状进行筛选核酸杂交技术筛选 重组体的鉴定1、根据重组子大小鉴定2、酶切鉴定3,PCR鉴定4.DNA序列分析鉴定第七章1基因表达（geneexpression）：DNA分子将其所承载的遗传信息，通过密码子-反密码子系统，指导合成功能RNA分子和蛋白质分子的过程。2.基因表达调控（generegulationorgenecontrol）：对基因表达过程的调节。基因表达调控的生物学意义，适应环境、维持生长和增殖；维持个体发育与分化。3.正转录调控(positive)：调节基因的产物是激活蛋白（activator）。也可根据激活蛋白的作用性质分为：正控诱导系统：效应物使激活蛋白处于活性状态。正控阻遏系统：效应物使活性蛋白处于非活性状态4.负转录调控（negative）:调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor）。根据其作用特征又可分为：负控诱导：阻遏蛋白与效应物结合，结构基因转录；负控阻遏：阻遏蛋白与效应物结合，结构基因不转录5.可诱导调节：编码糖和氨基酸分解代谢蛋白的基因6.弱化子：在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列，位于trpE基因的起始密码前162bp的前导区中的123-150位碱基序列。该区的mRNA可形成茎-环结构，有终止的作用。称为弱化子。7.细菌的应急反应：细菌碰到紧急状况(如氨基酸的全面匮乏)，会产生一个应急反应，包括生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止，而打开一些合成氨基酸的基因。应急反应的信号是鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp）,诱导物是空载tRNA。8.前导肽：在色氨酸操纵子的前导序列中可能存在前导肽，14个氨基酸。在第10和11位上有相邻的两个色氨酸密码子。前导区的序列分析：具有4个分别以1、2、3、4表示的片段，能以两种不同的方式进行碱基配对：1-2、3-4，或2-3配对。9.转录弱化作用：mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的。前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，这个前导肽的翻译必定对tRNATrp的浓度敏感。10.信号传导（signaltransduction）：细胞通过传感器（sensor）接收外界信号，然后传到调节部位。11.二组分调控系统（two-componentsystems）：由位于细胞质膜上的传感蛋白（sensorprotein）和位于细胞质内的应答调节蛋白（responseregulatorprotein）组成。12.魔斑（magicspot）：鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸(pppGpp)，可在层析谱上检出。细菌缺乏氨基酸时，会大量合成这两种化合物。影响RNA聚合酶与启动子结合。作为警报素，产生应急反应。抑制核糖体和其他大分子的合成，抑制与氨基酸转运无关的系统。活化某些氨基酸操纵子的转录和表达，活化蛋白水解酶等。空载tRNA激活焦磷酸转移酶GTP+ATP————————pppGpp+AMP→ppGpp13.可阻遏调节：合成代谢过程中所必需的小分子物质（氨基酸、嘌呤、嘧啶等）的基因。14操纵子(operon):是基因表达的协调单位，由启动子、操纵序列及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵子是原核基因表达调控的一种重要形式。15断裂基因：真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（splitgene）16顺式作用元件：存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子、增强子、调控序列、和可诱导元件等，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。17.魔斑核苷酸：受严紧控制的细菌生长过程中一旦缺乏氨基酸供应，细菌会产生一个应急反应，使蛋白质和RNA的合成速率迅速降下来。魔斑核苷酸指的就是此过程中大量GTP合成的鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp），它们的主要作用可能是影响RNA聚合酶与启动子结合的专一性，诱发应急反应，帮助细菌渡过难关。1.乳糖(lac)操纵子的负控诱导系统的结构和调控机制？（1）结构：与乳糖分解的三个相关基因：lacZ、lacY和lacA，结构基因上游为操纵基因lacO、启动子P、调节基因lacI，CAP结合位点，lacO为阻遏蛋白的结合位点，lacI编码阻遏蛋白，能识别操纵基因，并与之相结合，阻遏lacZYA基因的转录表达。（2）调控机制：乳糖操纵子是大肠杆菌中调节乳糖代谢的自动控制系统。CAP是正性调节因素，乳糖阻遏蛋白是负性调节因素有葡萄糖存在时细菌优先选择葡萄糖供应能量，葡萄糖通过降低cAMP浓度，阻碍cAMP与CAP结合而抑制乳糖操纵子的转录，使细菌只能利用葡萄糖。没有葡萄糖而只有乳糖存在的条件下，阻遏蛋白与lacO序列结聚，CAP结合cAMP后作用于乳糖操纵子的CAP结合位点，激活转录，使得细菌利用乳糖，将乳糖分解为半乳糖和葡糖糖，提供能量。2.原核基因调控基本概念，分类：基因表达调控（generegulationorgenecontrol）：对基因表达过程的调节。基因表达调控的生物学意义：适应环境、维持生长和增殖，维持个体发育与分化正转录调控：调节基因的产物是激活蛋白。正控诱导：效应物使激活蛋白处于活性状态。正控阻遏：效应物使激活蛋白处于非活性状态负转录调控：调节基因的产物是阻遏蛋白。负控诱导：阻遏蛋白与效应物结合，结构基因转录。负控阻遏：阻遏蛋白与效应物结合，结构基因不转录。3.原核基因调控的主要特点①诱导与阻遏（可诱导调节：编码糖和氨基酸分解代谢蛋白的基因，可阻遏调节：合成代谢过程中所必需的小分子物质（氨基酸、嘌呤、嘧啶等）的基因。）弱化子对基因活性的影响（起信号作用的是有特殊负载的氨基酰-tRNA的浓度，不同浓度的AA-tRNA决定了基因最终能否转录。当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段核苷酸称为弱化子。如色氨酸操纵子、苯丙氨酸操纵子等。）降解物对基因活性的调节葡萄糖效应（降解物抑制作用）葡萄糖代谢降解物降低细胞内cAMP的浓度,不能与环腺苷酸受体蛋白CRP或称代谢降解物激活蛋白(CAP)形成足够的cAMP-CAP活性复合物以促使RNA聚合酶与启动子的结合,葡萄糖敏感操纵子不能表达。细菌的应急反应（应急反应的信号是鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp）,诱导物是空载tRNA。）4.葡萄糖效应及其机制葡萄糖效应（降解物抑制作用）大肠杆菌生长在既有葡萄糖又有其他糖类(乳糖等)的介质中,只能利用葡萄糖,当葡萄糖耗尽后才能利用其他糖类,即葡萄糖阻断多种操纵子(葡萄糖敏感操纵子)的表达。葡萄糖效应机理（乳糖操纵子负控诱导系统的调节机制）葡萄糖代谢降解物降低细胞内cAMP的浓度,不能与环腺苷酸受体蛋白CRP或称代谢降解物激活蛋白(CAP)形成足够的cAMP-CAP活性复合物以促使RNA聚合酶与启动子的结合,葡萄糖敏感操纵子不能表达5.色氨酸操纵子的结构和调控机制?（1）结构：调节基因trpR、启动子P、操纵基因trpO、前导序列trpL、衰减子trpa，结构基因trpE、trpD、trpC、trpB、trpA（2）调控机制：trpR基因产物称为辅阻遏蛋白，与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合并关闭trpmRNA转录效应物使色氨酸，是由trp所编码的生物合成途径的末端终产物当培养基中色氨酸含量高时，核糖体翻译出前导肽，停止于终止密码子出，色氨酸与辅阻遏蛋白结合，与操纵区结合，阻遏mRNA的转录；当培养基中色氨酸不足时，辅阻遏蛋白失去色氨酸并从操纵区上结离，trp操纵子去阻遏，mRNA转录。6.lac操纵子中的其他问题A基因及其生理功能：编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶。能够把乙酰基从供体上转移到半乳糖苷分子上，抑制了β-半乳糖苷酶产物的有害衍生物在细胞内积累。Lac基因产物数量上的比较：1：0.5：0.2。LacmRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。产生5‘-3’蛋白合成梯度。在lacmRNA分子内部，A基因比Z基因更易受内切酶作用发生降解。操纵子的融合与基因工程7.弱化机制A.当色氨酸浓度低时，生成的tRNAtrp量就少，使核糖体沿mRNA翻译移动的速度慢，赶不上RNA聚合酶沿DNA移动转录的速度，这时核糖体占据1位的机会较多，使1、2不能配对，2、3配对，阻止了3、4生成终止信号的结构，trp操纵子处于开放状态。B.当色氨酸浓度增高时，核糖体沿mRNA翻译移动的速度加快，占据到2段的机会增加，2、3配对的机会减少，3、4形成终止结构的机会增多，转录减弱。C.当所有氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据1的序列，结果有利于1、2和3、4发夹结构的形成，于是转录停止。等于告诉细菌：“整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白质，不如不合成以节省能量”。8.半乳糖（gal)操纵子Gal操纵子的结构特征gal操纵子有两个启动子：S1和S2（转录起始点）。mRNA可以从两个不同的起始点开始转录。它有两个O区，一个在P区上游–67~-73，而不是在P区与结构基因之间，另一个O区在结构基因galE内部。葡萄糖cAMP-CRP；葡萄糖cAMP-CRP。S1的转录：无葡萄糖，有半乳糖，高浓度的CRP和cAMP。抑制S2的转录。S2的转录：有葡萄糖。cAMP-CRP有利于RNA聚合酶-S1区复合物的形成开链构象，从而起始基因转录。同时，由于S1和S2区的核苷酸部分重叠，这一复合物的存在干扰了RNA聚合酶-S2复合物的形成，抑制了S2起始的基因转录。9.阿拉伯糖操纵子3个结构基因：araB、araA、araD一个复合的启动子区、两个操纵区和一个调节基因araC。AraC蛋白同时具有正、负调节因子的功能。阿拉伯糖是诱导物。AraC蛋白本身是负调节蛋白-阻遏蛋白（Pr）；有阿拉伯糖、cAMP-CRP同时存在，AraC蛋白成为正调节蛋白-激活蛋白（Pi）；10.阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答SOS是细菌DNA受到破坏时，启动的诱导型DNA修复系统。LexA是SOS应答体系的阻遏蛋白。recA基因表达1000个RecA蛋白。DNA严重受损时，RecA蛋白与单链DNA缺口结合，被激活为蛋白酶，切割LexA蛋白使之失活。11.二组分调控系统和信号传导信号传导：细胞通过传感器（sensor）接收外界信号，然后传到调节部位。二组分调控系统：由位于细胞质膜上的传感蛋白和位于细胞质内的应答调节蛋白组成。12.多启动子调控的操纵子rRNA操纵子(rrnE)：两个启动子P1和P2，P1是强启动子，快速生长时；P2营养缺乏时，弱启动子。核糖体蛋白SI操纵子（rpsA）：四个启动子，P1、P2强启动子；P3、P4弱启动子。DnaQ蛋白操纵子：DNA聚合酶亚基，校正DNA复制；受RNA聚合酶活性调节；13.了解转录及转录后调控的主要几种方式转录水平上的调控：DNA的结构、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用转录水平上的其他调控方式：σ因子的调节作用b．组蛋白类似蛋白的调节作用：维持DNA的高级结构。H-NS蛋白：DNA结合结构域；蛋白-蛋白相互作用结构域；H-NS蛋白结合在DNA上，抑制基因的转录。转录激活需要特定的转录因子参与。转录调控因子的作用D．抗终止因子的调节作用转录后水平的调控：mRNA加工成熟水平上的调控；翻译水平上的调控mRNA自身结构元件对翻译起始的调节mRNA稳定性对转录水平的影响调节蛋白的调控作用反义RNA的调节作用稀有密码子对翻译的影响重叠基因对翻译的影响poly(A)对翻译的影响翻译的阻遏魔斑核苷酸水平对翻译的影响13.mRNA自身结构元件对翻译起始的调节起始密码子：AUG、GUG、UUG、AUU核糖体结合位点（RBS）：指起始密码子AUG上游的一段非翻译区。有SD(Shine-Dalgarno)序列，5个核苷酸，富含G、A，序列与核糖体16SrRNA的3‘端互补配对，促使核糖体结合到mRNA上，有利于翻译的起始。RBS的结合强度取决于SD序列的结构及其与起始密码AUG之间的距离。4-10bp，9个最佳。mRNA的二级结构也是翻译起始调控的重要因素：影响核糖体的结合。14.翻译的阻遏大肠杆菌RNA噬菌体QB：复制酶可以和外壳蛋白的翻译起始区结合，抑制蛋白质的合成。蛋白质在翻译阶段起阻遏作用。克服翻译与复制同时进行的矛盾。第八章1.断裂基因真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（splitgene）2.内含子（introns）是真核生物细胞DNA中的间插序列。这些序列被转录在前体RNA中，经过剪接被去除，最终不存在于成熟RNA分子中.3.外显子指的是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。4.基因簇同一套功能的组合家族基因成员紧密排列在一起所形成的一簇基因。5.增强子指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列，因为它能强化转录的起始，所以叫增强子。6.沉默子指能使与它连锁的基因转录频率明显减弱的DNA序列。（了解内容只需看看）1.了解真核基因表达调控的特征，主要步骤，以及与原核细胞在基因转录、翻译及DNA空间结构方面的差异。（1）一条mRNA只翻译出一条多肽链（单顺反子）（2）DNA与组蛋白和非组蛋白结合（3）基因组中有大量的重复序列（4）存在DNA重排、基因扩增现象（5）转录调节区复杂（6）转录在细胞核内，翻译在细胞质内（7）转录的RNA要经过复杂的成熟和剪切过程2.了解基因家族的种类基因家族可分为：1.简单多基因家族：由一个或数个基因经串联方式重复排列的基因家族。如大肠杆菌中的16S、23S和5SrRNA基因簇、爪蟾的5SrRNA基因、高等真核生物的18S、5.8S和28SrRNA基因簇等2.复杂的多基因家族：由几个相关基因家族构成，基因家族之间由间隔区分开，分别独立转录。如组蛋白基因家族。海胆的5种主要组蛋白基因存在于一个7Kb的重复单位中，5个编码区和5个不转录的间隔序列交替出现，构成一个基因簇3.发育调控的复杂多基因家族：人类珠蛋白基因家族是典型的受发育调控的复杂多基因家族。3.真核基因的结构（断裂基因、内含子、外显子）真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成。外显子-内含子连接区的高度保守性和特异性碱基序列。两个重要特征：内含子的两端序列之间没有广泛的同源性。外显子-内含子连接区序列高度保守：每个内含子5‘端起始的两个碱基都是GT,而3’端的最后两个碱基总是AG,称为GT-AG法则。4.真核生物DNA水平上的基因表达调控方式有哪些？合成RNA的DNA模板也会发生规律性变化，基因组发生了改变，真核生物发育调控的一种形式：通过基因丢失、扩增、重排和移位，消除和变换某些基因并改变它们的活性，从而控制基因表达和生物活性的方式。（1）基因重排：一个基因可以通过从远离其启动子的地方移到距它很近的位点而被启动转录。如：免疫球蛋白基因的重排（2）基因扩增：某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象。细胞在短时间内产生大量的基因产物以满足生长发育需要，是基因活性调控的一种方式（3）基因转换：酵母的“交配型转换”现象，通过基因转换改变性别（4）“开放”染色质结构对转录的影响真核基因与核小体组建成染色质和染色质成高度压缩。转录发生前，染色质在特定区域被解旋松弛（核小体、DNA机构改变、右旋型变构为左旋B→Z)，一方面暴露了结构基因，使启动区DNA易与RNA聚合酶及其他转录调控因子结合，从而启动转录，另一方面暴露了DNA酶I的超敏感位点。5.DNA甲基化、组蛋白乙酰化与基因活性的关系（1）DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导基因的活化和表达。能引起染色体结构。DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变。DNA甲基化对基因转录的抑制直接参与了发育调控。随着个体发育，当需要某些基因保持“沉默”时，它们将迅速被甲基化，若需要恢复转录活性，则去甲基化（2）组蛋白N端“尾巴”上赖氨酸残基的乙酰化中和了组蛋白尾巴的正电荷，降低了它与DNA的亲和性，导致核小体构象发生有利于转录调节蛋白与染色质相结合的变化，从而提高了基因转录活性。核心组蛋白H2A、H2B、H3、H4通过组蛋白“尾部”选择性乙酰化影响核小体的浓缩水平和可接近性。即乙酰化：基因转录活性提高;去乙酰化：基因转录活性降低6.顺式作用元件（启动子、终止位点、增强子）启动子：决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始点和转录频率的关键元件，在转录起始位点（+1）及其上游大约100-200bp内的一组具有独立功能的DNA序列，包括核心启动子和上游启动子元件。终止位点：3’端存在poly(A)位点，该位点上游15-30bp处有保守序列AATAAA。可能存在共同的转录终止机制增强子：能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。沉默子:某些基因的负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。7.反式作用因子中的DNA识别或结合域和转录活化结构域螺旋-转折-螺旋(helix-turn-helix,HTH)：锌指(zincfinger)结构碱性-亮氨酸拉链结构(basic-leucinezipper,bZIP)碱性-螺旋-环-螺旋结构(basic-helix/loop/helix,bHLH)同源域蛋白(homeodomains)具有转录调控功能的催化区域，常以复合物形式出现，依赖于DNA结合结构域以外的30-100个氨基酸残基完成蛋白质-蛋白质之间的相互作用。带负电荷的螺旋结构：一种酸性的螺旋结构，有稳定转录起始复合物的作用。如糖皮质激素受体AP1家族的Jun及GAL4富含谷氨酰胺的结构：如SP1、Oct1/2、Jun、AP2、血清应答因子（SRP）等。富含脯氨酸的结构：CTF-NF1、Oct1/2、Jun、AP2、SRP等。8.真核细胞在基因结构和转录翻译过程有哪些特点？真核细胞在转录翻译过程中的特点：1、真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译一条多肽链；2、真核细胞的DNA与组蛋白和大量非组蛋白结合，只有一小部分DNA是裸露的；3、高等真核细胞DNA中大部分不转录，只有一小部分由几个或几十个碱基组成的DNA序列，在整个基因组中重复几百次甚至几百万次，而且大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子；4、真核生物能够有序的根据生长发育阶段的需要进行DNA片段的重排，还能在需要是增加细胞内的某些基因的拷贝数；5、真核生物中，基因转录的调节区大得多，而且远离核心启动子几百个甚至上千个碱基对；6、真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经过转运穿过核膜，到达细胞质基质后，才能被翻译成蛋质；7、许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能被顺利地翻译成蛋白质。真核细胞在基因结构的特点：一个完整的真核基因不但包括编码区，还包括5'和3'端长度不等的特异性序列，这些序列不编码氨基酸，但是却在基因表达过程中起着重要的作用。而基因转录调控的基本要素包括顺式元件、反式作用因子和RNA聚合酶9.了解RNA加工成熟rRNA的加工成熟分子内切割：45S前体，核酸酶，成熟的18、28、5.8SrRNA。化学修饰：碱基甲基化（原核），核糖甲基化（真核）。tRNA的加工成熟可能先生成前体tRNA，核苷修饰，生成4.5S前体tRNA,再剪接成4S成熟tRNA。mRNA的加工成熟：先转录成核不均一RNA(hnRNA)5’’端加”帽子”；3’’端加上poly(A)；剪接；核苷酸的甲基化10.了解翻译水平的调控涉及蛋白质合成的4种成分：核糖体mRNA可溶性蛋白因子tRNA（详细内容可看看PPT）第九章1.病毒癌基因致瘤病毒中能在体内诱发肿瘤并在体外引起细胞转化的基因。2.原癌基因存在于细胞基因组中，正常情况下处于静止或低水平表达状态，对维持细胞正常功能具有重要作用，且当受到致癌因素作用而被活化而导致基因恶变的基因。3.抑癌基因细胞内一类抑制肿瘤发生、生长，能对抗癌基因的作用的基因4.HIV人免疫缺陷病毒，俗称艾滋病毒，可诱发人类获得性免疫缺损综合征的病毒。主要攻击人体的免疫系统中重要的T4淋巴细胞，大量吞噬、破坏T4淋巴细胞，从而使得整个人体免疫系统遭到破坏，最终因丧失对各种疾病的抵抗能力而死亡。5.基因治疗（genetherapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。6.SARS-CoV严重急性呼吸综合症冠状病毒，基因组为单链正链RNA，为最大的RNA病毒，共14个开放读码框，重组率非常高。1.原癌基因是如何激活的？在很多情况下，原癌基因的结构发生了点突变或插入、重排、缺失及扩增等，改变其转录活性。（1）点突变：原癌基因活化导致癌变最常见的机制（2）LTR插入:LTR是反转录病毒基因组两端的长末端重复序列，其结构中含有强启动序列，当LTR插入原癌基因启动子区域或邻近部位后，可从根本上改变基因的正常调控规律（3）基因重排：原癌基因之间；原癌基因与非原癌基因之间（4）缺失：很多原癌基因在5上游区存在负调控序列，一旦该序列发生缺失或突变，就丧失抑制基因表达调控的能力。（5）基因扩增：使每个细胞中基因拷贝数增加，从而直接增加可用的转录模板；在肿瘤细胞中，DNA扩增事件的发生频率比正常细胞中高上千倍；发生基因扩增的肿瘤细胞将获得选择性生长优势。一些环境因素如：饮食、病毒、化学物质、射线等都会引起原癌基因的结构发生点突变或插入、重排、缺失、扩增等，改变其转录活性。2.HIV的复制gp120与CD4结合，病毒核心蛋白和RNA进入细胞，反转录酶以病毒RNA为模板合成单链DNA，并由宿主细胞DNA聚合酶合成双链DNA（原病毒），经环化后进入细胞核并整合到染色体上，随细胞分裂传递，长期潜伏。主要过程：1、原病毒整合到宿主染色体上，无症状2、原病毒利用宿主细胞的转录和合成系统转录产生病毒mRNA，其中一部分编码病毒蛋白，与基因组RNA组装成新的病毒颗粒，从寄主细胞中释放出来侵染其它健康细胞寄主细胞瓦解死亡3.HBV的复制第一步：病毒脱掉外壳，基因组DNA进入细胞核，经DNA聚合酶修复正链缺失部分，形成共价闭环双链DNA，大量扩增。第二步：在宿主的RNA聚合酶作用下转录，3.5kb前基因组RNA从5‘端DR1处开始，经DR2后继续合成，终止于DR1后85碱基处的的TATAAA序列，比病毒DNA多130－270个碱基。第三步：前基因组的部分RNA被包装入核心颗粒，并进行反转录，以与母链连接的末端蛋白为引物，合成负链DNA。由RNaseH将模板降解，但5’端帽子结构到DR1区域不被降解，作为正链合成的引物。第四步：在DNA聚合酶作用下合成正链，“引物易位”，未完成时，包装成病毒颗粒，形成不完整的双链基因组。10基因与发育2013简述免疫球蛋白基因结构特点。在生殖细胞基因组中，V基因和C基因呈分隔独立排列的结构。这种排列类型称为种系类型，存在于所有的体细胞中。编码一条免疫球蛋白多肽链的基因是种系DNA上数个分隔开的DNA片段经重排后产生的。免疫球蛋白分子由Igκ、Igl和Igh基因编码，它们是3个基因家族，分别位于不同的染色体上。简述Ig基因重排的原理及过程。轻链基因的重组在小鼠胚系DNA中，Vκ、Cκ、Jκ基因片段编码κ轻链：①L-Vκ由前导序列和Vκ组成。Vκ编码轻链可变区的大部分氨基酸。L编码信号肽，此是Ig分泌所必须的，但并不参与抗体分子的功能；②Cκ片段：编码κ轻链的C功能区；③Jκ片段：连接片段，在有功能的κ轻链基因的产物中用来连接Vκ和Cκ。重链基因的重组Ig重链基因也是由VH、JH和CH片段编码的。但比轻链还多了个D（diversity）基因片段，它位于VH和JH片段之间。在小鼠的胚系中L-VH串联排列，然后是一组12个D片段，再接着是4个JH片段。在恒定区基因是由一组基因组成，在小鼠中此基因簇依次为μ、δ、γ3、γ1、γ2b、γ2a、ε、α八个基因。分别编码重链IgM，IgD，IgG，IgE和IgA的恒定区。当与L链基因重排时，抗体的多样性除了V、D、J、C的不同连接外，还依赖于L链和H链的连接。

什么是等位排斥与同型排斥？说明Ig°、Ig+和Ig-的含义。等位排斥：一个B淋巴细胞只能产生一种抗体。对于重链基因来说，一个染色体上重链基因重排成功会抑制另一个染色体上重链基因的重排，如果第一个染色体上的重链基因重排失败，则另一个染色体上的重链基因发生重排。只有重排成功的基因才能表达。同型排斥：对于轻链基因来说，先进行κ基因重排，只有当两个染色体上的κ基因都重排失败后，才会进行λ基因的重排。所以一个B淋巴细胞中产生的抗体，要么两条轻链都是κ链，要么都是λ链。Ig°：未发生重排的种系构型等位基因Ig+：发生重排并进行功能表达的等位基因Ig-：发生无效重排的无活性等位基因什么是母源效应基因？果蝇有哪些轴决定母源效应基因？母源效应基因（maternaleffectgenes）卵母细胞自身的细胞核不具转录活性，而由母源抚育细胞、滤泡细胞和脂肪体细胞利用自身的基因和细胞资源提供遗传信息和营养物质，然后输入到卵母细胞中。从母源细胞输入到卵母细胞中的基因称为母源效应基因。4组轴决定母源基因前端系统：bicoid和hucchback，决定头和胸部的分节后端系统：nanos和caudal，决定腹部分节末端系统：torso等9个母源基因，决定胚胎两端不分节的原头区和尾节背腹极性基因：toll、spatzle、dorsal请说明调控果蝇前-后轴形成关键基因的表达顺序？4个母源效应基因参与调控胚胎前-后轴形成:biocoid和hunchback调控胚胎前端结构的形成；nanos和caudal调控胚胎后端结构的形成。表达顺序：在果蝇发育的卵细胞阶段，由于抚育细胞和卵泡细胞的分泌和诱导，在长椭圆形的卵细胞两端分别差异性地锚定和贮存了特异性翻译调控因子biocoid和nanosmRNA。进入胚胎发育阶段后，biocoid蛋白由前向后梯度性递减，nanos则呈梯度性递增分布。biocoid蛋白对caudalmRNA、NANOS蛋白对hunchbackmRNA的翻译分别具有抑制作用，使hunchback蛋白含量由前向后逐渐降低，而caudal蛋白的含量则渐次增高。花器官的同源异型突变有哪几种类型？花器官的同源异形突变包含四大类型：类型I为第一轮和第二轮器官受影响，产生心皮状的花萼和雄蕊状的花瓣。类型II为第二轮和第三轮器官受影响，产生花萼状的花瓣和心皮状的雄蕊。类型III为第三轮和第四轮器官受影响，产生花瓣状的雄蕊和花萼状的心皮，而且最内两轮器官的数量和轮数也发生了改变。类型IV中四轮结构全部受影响。研究发现，每种类型突变体都是因为发生了同源异形基因的突变而使相邻两轮花器官受到影响。7什么是花器官发育的“ABC”模型？“ABC”模型的提出在对拟南芥和金鱼草突变体及花器官特征决定基因功能的研究中，E.Myerowitz提出了控制花形态发生的“ABC”模型。根据这个模型，正常花的四轮结构的形成是由三组基因共同作用而完成的。每一轮花器官特征的决定分别依赖于A、B、C三组基因中的一组或两组基因的正常表达。如其中任何一组或更多的基因发生突变而丧失功能，则花的形态将发生异常。A基因在第一、二轮花器官中表达，B基因在第二、三轮花器官中表达，C基因在第三、四轮花器官中表达。A基因本身决定萼片，A和B基因共同决定花瓣，B与C基因共同决定雄蕊，C基因决定心皮。A基因突变后（如ap1、ap2），第一轮花器官中的花萼突变为心皮，第二轮花器官中的花瓣突变为雄蕊。B基因突变后（如ap3、pi突变体），花萼替代了第二轮花器官中的花瓣，第三轮花器官中的雄蕊变为心皮。若C基因失活（如ag突变体），则第三轮花器官中的雄蕊变成花瓣，第四轮花器官中的心皮转变为花萼。对ABC模型的修正图经修改后的“ABC”模型。A：AP2基因和花同源异型MADS盒基因与植物花发育的关系