免疫沉淀结合质谱分析筛选相互作用蛋白

具体步骤：免疫共沉淀〔Co-immunoprecipitation〕培育HEK293FT细胞至90%集合，将pCMV-Myc-AP-2β用磷酸钙转染法转入HEK293FT细胞中。磷酸钙转染方法:100mm10m1不含抗生素的培育液培育细胞。转染的当天，细胞密度最好到达90-95%，吸掉旧培育液，PBS漂洗一次，换成l0mL无血清无抗生素的培育液。将待转染的外源DNACaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液；d、在不断搅拌振荡过程中，逐滴缓缓地参与到HEPES-磷酸钙溶液中去，形成一种磷酸钙-DNA共沉淀；e.将磷酸钙-DNA复合物滴参与细胞中，轻轻混匀，常规条件培育。f.磷酸钙-DNA4-6h后，换成有血清和抗生素的培育液。(2)24h1xPBS悬浮细胞并用细胞刮收集细胞。4500g23min，弃上清沉淀用RIPA缓冲液重悬。细胞于-8015min3715min。重复两次。80412023r/min10min，上清转移至管WesternBlotMyc的多抗，另一半参与免4h.参与protein-A/G6h或过夜.4500g2min，弃上清珠子用裂解缓冲液重悬。重复三次。(8)20uL的加样缓冲液重悬，1055min.(9)10%SDS/电泳后，将蛋白胶进展银染。蛋白银染和质谱分析样品的制备2.2.3.1 蛋白银染电泳完毕后,将胶留神取下,双蒸水洗两次,然后进展凝胶染色，银染方法如下：2h或者过夜。20min,三次2min.5min,三次。30min.1min,2次。5~10min.终止液终止。双蒸水漂洗干净，置双蒸水中保存。质谱分析样品的制备:从胶中切取区分较好的4蛋白质带,置于1.5mlEppendorf管中,对染色的蛋白质带分别进展脱色、复原、烷基化、酶解、萃取等处理,将制备好的样品用于质谱分析.银染蛋白质点酶解步骤：水洗：双蒸水漂洗银染后的胶，摇床上洗2-3次，每次10min.成像，取点：胶做完后即扫描，然后取点。脱色，水洗：脱色工作液：30mmol/LK3Fe(CN)6:100mmol/LNa2S2O3=1：14.50%1-215min.脱水：100%100%乙晴脱水一次。25mMNH4HCO35min，再吸出。75。冻干：用封口膜封口，扎孔，冻干机中冻干20min,取出时小扣EP管底，其中白色胶块在管中轻快跳动即可。复原：加复原剂，封口。57度水浴一小时。3复原剂：25mM的NH4HCO〔10mM二硫苏糖醇DTT〕3烷基化：从水浴锅中取出样品后，室温冷却，去掉过量的液体，快速参与同体积的烷基化试剂室温暗处放置30min.25mM的N4HC3含55mMIA。11.终止烷基化反响，洗掉IAA.25mMNH4HCO3洗胶块两次。5。吸胀：参与25mM的N4HC3震荡，静置5min吸出。5。冻口：冻干机中冻干30min，完全冻干。加酶：加适量酶液〔切胶仪切的胶块每管参与4ul酶液，冰上放30min.3酶液的配制：将酶液用掩盖液〔10%乙晴，25mMNH4HCO〕0.02ug/ul。17.检查酶液吸胀状况，多余的酶吸走，酶液不够，即胶块中还有白色，则参与适量的酶液。320ul封口，3716-18小时。蛋白质酶解后蛋白用品的提取将样品从37度水浴锅中取出后，10000g 2 min.将上清转移到洗干净的EP管中，剩余胶块中参与萃取液〔2.5%三氟乙酸，67%乙晴forMALDI〕,373min.15min,5min15min40度。23.10000g 2 min,合并上清。24.2-5ul供质谱检测。质谱分析和数据库查询:制备好的样品送到湖南师范大学蛋白质组学试验室，使用美国BRUKER公司的ProFlexTMIIIMALDI-TOF质谱仪进展分析,获得的混合物肽片段质量数据通过借助Micromass公司配备的专用软件MASseq直接推导出肽段序列,再用推断的序列与肽段质量相结合,查询数据库对蛋白质进展鉴定.附录:银染方法2h或者过夜。20min,三次2min.5min,三次。30min.1min,2次。5~10min.终止液终止。双蒸水漂洗干净，置双蒸水中保存。试剂配方：200ml,48ml,152ml200ml.173ml,327ml。0.137g400ml。4银染液：AgNO30.05-0.1g,10-20ul,25ml.显色液：Na2CO31.5g,10ul,350ul,25ml.200ml,48ml,152ml.银染蛋白质点酶解步骤：水洗：双蒸水漂洗银染后的胶，摇床上洗2-3次，每次10min.成像，取点：胶做完后即扫描，然后取点。脱色，水洗：脱色工作液：30mmol/LK3Fe(CN)6:100mmol/LNa2S2O3=1：14.50%1-215min.脱水：100%乙晴脱水至胶块成白色，诺是震荡后一次反响胶块没有变白，可将乙100%乙晴脱水一次。25mMNH4HCO35min，再吸出。75。冻干：用封口膜封口，扎孔，冻干机中冻干20min,EP管底，其中白色胶块在管中轻快跳动即可。复原：加复原剂，封口。57度水浴一小时。复原剂：25mM的NH4HCO3〔10mM二硫苏糖醇DTT〕参与同体积的烷基化试剂室温暗处放置30min.烷基化试剂：25mM的N4HC3含55mMIA。终止烷基化反响，洗掉IAA.25mM的NH4HCO3洗胶块两次。5。吸胀：参与25mM的N4HCO3震荡，静置5min吸出。5。冻口：冻干机中冻干30min，完全冻干。〔切胶仪切的胶块每管参与4ul酶液30min.酶液的配制：将酶液用掩盖液〔10%乙晴，25mMNH4HCO3〕0.02ug/ul。检查酶液吸胀状况，多余的酶吸走，酶液不够，即胶块中还有白色，则参与适量的酶液。20ul封口，3716-18小时。三，蛋白质酶解后蛋白用品的提取将样品