抗肿瘤药物筛选课件

抗肿瘤药物筛选侯桂琴郑州大学药学院一细胞筛选筛选方法1.四氮唑蓝（MTT）还原法原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值应用：用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。特点：灵敏度高、经济。

缺点：产物不溶于水，需被溶解后才能检测。步骤：（1）制备单细胞悬液；(2)对细胞进行计数，计数后接种于96孔板，一般每孔细胞数为5000个（可先做细胞倍增试验确定每孔中最佳细胞数）；（3）将培养板放入CO2培养箱，过夜培养；（4）24h后更换培养基，并在每孔细胞中加入不同浓度药物，继续培养；（5）24或48h以后，加入MTT溶液，再培养3-6h,停止培养，弃取培养基,加入DMSO，每孔150ul，轻微震荡混匀；（6）把96孔板放入酶标仪中，490nm测定吸光度。CCK-8法2.集落形成法：测定单个细胞的增殖能力原理：单个细胞在体外持续分裂增殖6次以上，其后代所组成的细胞群体，称克隆或集落。一般50个以上细胞，通过计数克隆形成率，定量分析单个细胞的增殖能力。用途：抗癌药物敏感性试验，肿瘤放射生物学试验常用方法：平板克隆形成试验，软琼脂克隆形成试验注意：适合贴壁细胞，细胞要分散均匀，操作要柔和。3.台盼蓝排斥试验原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。

活细胞总数×100活细胞率（％

）＝活细胞总数＋死细胞总数注意：简单，最常用。染色时间不宜过长。特点：悬浮细胞较方便，贴壁细胞要进行消化，此步误差大。二微生物学筛选方法(抗肿瘤抗生素)1.噬菌体法噬菌体：是一类能感染微生物的病毒（1）抗噬菌体法：干扰DNA代谢的抗生素如放线菌素、博来霉素常能抑制噬菌体在细菌细胞内的生长，从而不产生噬菌体颗粒而出现抗噬菌体的现象。（2）溶原性菌诱导法：除烈性噬菌体外，还有一种噬菌体，其基因组直接螯合到细菌染色体DNA，不复制，因其大部分基因功能受到了“阻遏物”阻抑，这种带前噬菌体的菌株称温和性或溶原性菌。但是当“阻遏物”的量由于细胞内或环境因子（物理、化学）而降低时，溶原性就不能维持，前噬菌体开始生长，是细菌裂解，称为诱导作用。一些抗肿瘤抗生素有诱导能力。2.细菌变种法(1)人工培育变种如:使细菌模仿肿瘤细胞的某些代谢特点使细菌对核酸或蛋白合成抑制剂敏感(2)检测突变作用如:依赖链霉素的菌株3.抗代谢法

抗代谢物在无机氮源的合成培养基中显示抗菌作用，而在普通有机氮源的营养培养基中无抗菌作用（因为有机氮源可将具有抗菌作用的物质代谢），利用此特点，选择无机氮源试验有抗菌作用的物质，作为抗代谢的初筛方法。三精原细胞法(抗生素和植物药)1.建立依据B型精原细胞具有高度敏感性2.实验方法及判定22－28g雄性小鼠，药物直接注入睾丸，不同浓度，每一浓度用2－3只，注射3天，处死动物，睾丸固定，石蜡包埋切片，苏木精－伊红染色，显微镜观察。四利用分子靶点筛选1.抑制血管生成的筛选模型体外：血管内皮细胞培养体内：动物眼角膜囊地鼠颊囊裸鼠外耳皮下鸡胚绒毛尿囊膜鸡胚绒毛尿囊膜模型鸡胚的生物学构造尿囊卵黄囊对照组低浓度药物实验组中浓度药物实验组高浓度药物实验组操作步骤：（1）于实验前72h孵育受精蛋（2）实验进行前以照蛋箱透照孵育的种蛋，凡已正常发育的种蛋可照见胚胎的影子，用铅笔做记号，弃取未发育种蛋（3）用碘酒、酒精消毒蛋壳。敲碎蛋壳把鸡胚移入平皿中，加入EagleFs培养液5-10ml，然后，可选择在鸡胚尿囊膜血管网的任何位置放置小块明胶海绵作为筛选抗血管生成药物的载体，然后加入不同浓度的血管生成抑制剂。（4）于加药后24h、48h和72h分别在显微镜下观察药物作用结果，并照相。（5）血管计数。可结合自动图像分析系统、摄像等技术完成血管生成抑制率＝（对照组血管面积－药物组血管面积）/对照组血管面积×100％2.以端粒酶为靶点的药物筛选端粒：真核细胞染色体末端的特殊结构。功能是维持染色体稳定性。，防止染色体DNA降解，保护染色体结构基因，调节正常细胞生长。“生命的时钟”“有丝分裂的计数器”端粒酶功能：通过其逆转录酶活性复制和延长端粒DNA来稳定染色体DNA端粒的长度。端粒酶活性测定方法端粒酶抑制剂3.细胞凋亡通路靶点

细胞周期调控靶点与侵袭相关的靶点耐药相关的分子靶点靶点选择原则：特异性、有效性、综合性、个性化五动物模型整体动物实验法是评价一个药物是否有效的最主要方法整体动物在肿瘤药理学研究中的作用：1.研究新开发药物对肿瘤的防治作用；2.对抗肿瘤药物进行筛选，探索抗肿瘤机理；3.探索药物和目前常规肿瘤治疗方法的综合应用以提高疗效。

常用宿主动物：裸小鼠（“活的试管”）特点：先天无毛，无胸腺，T淋巴细胞功能完全缺失，对异种移植不产生排斥反应。缺点：费用高，饲养条件高，不宜大量繁殖。一般不用于初筛。应用：观察药物对癌细胞逆转作用，抑制增殖及诱导凋亡作用。C57BL/6小鼠特点：黑毛，体型小，性情温顺，易饲养，药敏性好，为研究Lewis肺癌首选。应用：药物体内初筛。模型建立方法实体瘤建立及评价：1.小块瘤体接种法2.肿瘤细胞悬液接种法3.培养细胞移植法疗效评价：肿瘤抑制率＝（对照组瘤重－给药组瘤重）/对照组瘤重×100％腹水瘤建立及评价：评价：对照组通常2-3周内死亡，治疗组一般观察50d左右，计算生命延长率。生命延长率＝（治疗组平均存活天数－对照组平均存活天数）/对照组平均存活天数×100aysTumorValume(mm3)ACabcdBab六基因芯片技术1.原理是一种建立在杂交测序基本理论上的全新技术，它利用固定在芯片上的几万至几十万条探针与样品进行杂交，在一步实验中获取大量的信息。2.基本技术路线①基因的选择与实验设计

根据表达谱数据库选择5000-10000个与发育及疾病相关的基因，制备药物筛选芯片。②芯片的制备③细胞的培养与药物刺激

根据目的药物及表达谱芯片数据库中细胞表达谱选择适当的细胞系，用适当计量的药物加入细胞培养液中，不同的时间取样，抽提刺激前后的mRNA。④大白鼠饲养与药物刺激

用常规方法饲养大白鼠，用适当计量的药物喂养大白鼠，不同的时间取大白鼠的适当器官（根据所筛选的药物而定），