光谱分析法课件

第五章光谱分析法汇报人：某某某汇报时间：2023.X.X紫外－可见分光光度法荧光分析法原子吸收分光光度法常用的光谱分析法1.紫外可见分光光度法用于体内药物分析的特点：

优点：简单、快速

缺点：专属性差、灵敏度低（10-7g/mL）一、紫外可见分光光度法（UV－Vis）

Ultraviolet-visibleSpectrophotometry

2.UV－Vis法原理和影响分析的因素（1）原理：Lambert－Beer定律（单色光）

在定量分析时，特别强调的是在一定的浓度范围内和给定的波长条件下测定，Lambert-Beer定律才成立。否则产生对该定律的偏离。谱带宽度、溶液的pH、被测物在溶剂中发生缔合、解离或溶剂化等因素均可使直线偏离，在测定过程中都会产生误差，均需引起注意。3.体内药物UV－Vis分析法的建立（1）灵敏度较低药物的吸光强度与其实际欲测血药浓度是否匹配。药物名称溶剂λ(nm)A=0.4时浓度（10-6g）有效血药浓度（10-6g）乙酰水杨酸0.1HCl229434920—300茶碱0.1HCl27245496--20异戊巴比妥0.1NaOH244365111--4咖啡因0.1HCl27549081--8氯丙嗪0.1HCl25610354150苯妥因钠MeOH2582913810--20异烟肼0.1HCl2654209.55--15利多卡因0.1HCl235401001.5-7磺胺嘧啶0.1HCl2425976.7100-150甲磺丁脲EtOH228500850-100部分药物和有效治疗浓度（2）专属性较差萃取、纯化计算分光光度法进行“数学分离”：差示分光光度法双波长法导数分光光度法例1

差示分光光度法测定血浆中的水杨酸水杨酸在不同pH条件下的紫外吸收光谱有显著差异，而血浆中的杂质在不同pH下紫外吸收光谱不变。水杨酸

C7H6O3∵ANaHCO3＝A水杨酸＋A杂质AH2SO4＝A水杨酸′＋A杂质′且A杂质＝A杂质′∴ΔA＝AH2SO4-ANaHCO3∝C水杨酸

可用于测定水杨酸血药浓度标准曲线的制备取空白血桨0.5ml分置5支10ml具塞离心管中，依次在每管中加入水杨酸标准贮备液（1mg/ml）0.10、0.15、0.20、0.25、0.30ml，混匀。各加入2滴0.25mol/LH2SO4并振摇1min使酸化，再各加入2.0ml二氯甲烷,涡旋混匀，离心（2500r/min）15min。用滴管吸去上清液及血块，精密吸取二氯甲烷层1ml至洁净试管中，精密加入5%NaHCO310ml反提。各精密吸取反提液4ml，分置成对的试管中形成两个等浓度系列，其中一个系列加入0.3ml的5%NaHCO3；另一个系列逐滴小心加入浓H2SO40.3ml，摇匀，超声处理10分钟消去气泡。取上述五组浓度相同，pH不同的溶液，在244nm处分别测定差示吸收值（

A）。以浓度C为横坐标，以差示吸收值

A为纵坐标，绘制标准曲线或进行回归，求得回归方程和相关系数。血药浓度测定精密量取0.5m1血浆样品按“标准曲线的制备”项下操作，测得

A样，从标准曲线上查得或根据回归方程求出血药浓度。空白血浆与血浆样品的来源应一致两个不同pH系列的操作必须遵循平行操作原则讨论例2兔血清中氨茶碱的双波长分光光度法测定

茶碱血浆蛋白结合率高，个体差异大，且治疗血药浓度较窄（5～20

g/ml），血药浓度高于25

g/ml时常出现中毒症状，因此要加强临床血药浓度的监测工作。原理：茶碱的λmax＝274nm空白血清A274≠0;但空白血清在A298＝A274

因此以274nm为测定波长，298nm为参比波长，双波长分光光度法测定氨茶碱血药浓度。

△A与茶碱浓度有良好线性关系。空白血清不存在干扰，每次测定时无需用空白血清校正，这样在治疗监测中，避免了取空白血清的麻烦。血清样品的制备吸取血清样品0.5ml置离心管中，加0.1mol/L盐酸溶液0.2ml，精密加入三氯甲烷∶异丙醇（95∶5）溶液5ml，振摇混合，离心（2500r/mim）10min，吸取三氯甲烷液（下层）4.0ml置另一离心管中，加入0.1mol/LNaOH溶液4.0ml，振摇均匀，离心（2500r/mim），吸取碱液（上层）3～3.5ml，供测定用。标准曲线的制备取茶碱标准溶液（0.5mg/ml）5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0

l加入空白血清0.5ml中混匀，使其浓度为5、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0

µg/ml，按“样品的制备”方法操作，以0.1mol/LNaOH溶液为参比，于274nm和298nm处测定吸光度，计算△A。以△A为纵坐标，对应的浓度C为横坐标，绘制标准曲线或进行回归，求得回归方程和相关系数。血药浓度测定以0.1mol/LNaOH溶液为参比，吸取上层碱液3～3.5ml为样品，于274nm和298nm处测定吸光度，计算△A样。从标准曲线上查得或根据回归方程求出血药浓度。例3导数分光光度法

二、荧光分析法（Fluoromertry）某些物质受激发光（紫外光或可见光）照射后能发射出比激发光波长更长的光，激发光停止照射后，光线随之消失，这种光称为荧光，为发射光。特点：

*灵敏度高（10-10~10-12g/mL）

灵敏度高，易受干扰，须做空白

*选择性好

*稀溶液中浓度与荧光强度成正比

只有在很稀的溶液中，即当ECl≤0.05时，

荧光强度与被测物浓度间的关系才成正比关系：

F＝2.3kφf

I0ElC（一）定量依据：K（二）影响荧光强度的因素内因:分子结构1.长共轭结构

π键的共轭度↑→λex和λem长移，荧光效率↑2.分子的刚性和共平面性↑→λex和λem长移，荧光效率↑3.取代基作用给电子基团→荧光↑；吸电子基团→荧光↓

外因:1.温度温度↑→荧光↓2.溶剂极性↑→荧光↑，粘度↓→荧光↓3.pH主要影响弱酸、弱碱物质4.荧光猝灭剂如卤素离子、重金属离子等5.激发光会造成荧光物质分解，快速测定6.散射光波长与荧光波长接近，对测定有干扰（三）方法与应用1.常规荧光分析法例1荧光分光光度法测定血清中诺氟沙星浓度（直接法）

测定条件选择：20µg/ml诺氟沙星水溶液

λex＝335nm;λem＝450nmpH4～5标准曲线的制备取诺氟沙星标准溶液（200µg/ml）1、2、5、10、20、30、40µl，分别加入健康人血清1.0ml，摇匀，加10％三氯醋酸3.0ml，在液体快速混合器上振荡1min，离心（3000r/min）5min。取上清液3.0ml，加1mol/LNaOH1.32ml，pH4.5醋酸－醋酸钠缓冲液0.5ml，摇匀，测定荧光强度，同时取空白血清同法操作做空白校正，经回归分析得线性方程。线性范围0.2～8µg/ml血药浓度测定取血清1.0ml，加10％三氯醋酸3.0ml，在液体快速混合器上振荡1min，离心（3000r/min）5min。取上清液3.0ml，加1mol/LNaOH1.32ml，pH4.5醋酸－醋酸钠缓冲液0.5ml，摇匀，测荧光强度，同时以标准管对照，计算血药浓度。2.间接测定法化学引导荧光法

利用化学方法可以使一些本身不能产生荧光的化合物转变成荧光化合物，并且改善了方法的选择性。反应机理：改变了分子结构，增加了π电子共轭系统的长度或增加了分子结构的刚性和共平面性，从而增加了荧光强度。常用的化学处理方法主要有下面几类：1.氧化还原反应

例1吗啡在弱碱性条件下可被铁氰化钾氧化成比其本身荧光强得多的二聚物伪吗啡。测定体内吗啡含量，可将提取纯化后的水溶液调节pH至8.5，加入K3Fe(CN)6使其反应，测定反应液的荧光强度（λex350nm，λem440nm），线性范围0.1－8.0µg/ml。λex350nm，λem440nm

例2苯妥因在碱性条件下可被高锰酸钾氧化成二苯酮，在浓H2SO4作用下产生强烈荧光：（λex360nm，λem490nm）。

先用二氯乙烷萃取，NaOH溶液转溶后，KMnO4氧化，正己烷萃取，浓H2SO4回提，然后测定荧光。λex360nm，λem490nm

例3体液中甲基多巴的测定可用K3Fe(CN)6氧化，产物经碱化、重排生成具有强荧光的二羟基吲哚类化合物，在λex400nm，λem510nm测定荧光强度。例4尿液中维生素B1的测定可利用其在碱性溶液中被K3Fe(CN)6氧化成硫色素，用正丁醇萃取，有机层显强蓝色荧光。

λex365nm，λem435nm。例5苯骈噻嗪类药物经过氧化氢、高锰酸钾等氧化剂作用可生成亚砜结构，具有强荧光，可用于测定体液中微量药物。λex340nm，λem380nm。2.水解反应

例1氨苄青霉素在pH2的缓冲液中，以甲醛为催化剂，90℃加热2小时，水解生成具有强烈黄色荧光的化合物。经溶剂萃取，再转溶于1mol/LNaOH溶液中，测定荧光强度（λex346nm，λem422nm）。生成的荧光产物可能是哌嗪二酮衍生物。λex392nmλem478nm3.缩合反应

例1血清中异烟肼的测定，可利用其在醋酸酸性溶液中与水杨醛缩合成腙，经巯基乙醇还原后有强烈荧光。

λex392nm，λem478nm，

最低检出浓度：0.01µg/ml例2色胺和5－羟色胺与甲醛缩合，生成的化合物，经氧化后生成一个发强荧光的“norharman”

λex365nm，λem440nmλex365nm，λem440nm4.络合反应

例四环素类与Ca2+及巴比妥盐形成具有荧光的络合物，经有机相萃取后，测定。巴比妥参与络合使生成物脂溶性增加，易被萃取。光化学反应荧光分析法（photochemicalfluorescencespectroscopy,PCF）

基于物质吸收了紫外可见辐射而引起光化学反应，导致结构或性质发生了某些变化，造成荧光增强或猝灭及波长发生移动等现象，从而使物质的荧光性质得到改善，提高它的灵敏度和选择性。特点：

①光化反应容易诱导高环系化合物生成，某些非荧光物质或弱荧光物质经光照后，分子刚性增强，荧光量子产率显著提高。如：用紫外光照射二己烯酚（DES），使环合成强荧光物质二己烯酚（DES）光照后环合成强荧光物质②入射光波长不同，会诱发不同的光化反应。这种反应专一性将提高分析方法的选择性。

③光子加入体系，不会引入杂质，不会稀释试样，可避免加入化学试剂带来的许多不利因素。④许多光化反应是通过游离基进行的，反应速率高，完全，有利于在线分析。

这些特点无疑对体内药物分析是非常有利的。体内药物分析中的应用

①苯骈二氮杂卓类：氯羟安定在0.2mol/LNaOH介质中，经光照生成芳香性更强的异构体，荧光强度显著提高。人血清中氯羟安定检测限为0.3µg/ml。

氯氮卓（利眠宁）的测定是在pH为4.2的缓冲液中，置紫外（汞灯）灯下12cm处照射40min，取出后空气中平衡10min。

λex265或370nm，λem442nm，

浓度0～3.00µg呈良好线性。

氯氮卓光照前后的光谱图λex265或370nm，λem442nm②吩噻嗪类

该类药物广泛用于治疗精神病。血清及尿液中吩噻嗪的常规测定方法缺乏足够的灵敏度。由于它是一类光活性物质，光氧化可使其荧光强度增强，发射波长长移，方法简单、快速、灵敏，检测限可达ng/ml级。③其它

大麻酚本身是非荧光物质。经光照开环，H转移，去H，最后闭环生成强荧光物质羟氢菲。用HPLC－PCF分析尿中大麻酚，检出限低于1ng。PCF在体内药分中的应用被测物试样检测限被测物试样检测限VK1血清30pg氯羟安定血清尿0.3µg/ml乙醇4ng氯芪酚胺血清尿60pg丙醛4ng大麻酚尿1ngclobazam血尿70pg伯氨喹血清0.9ngDesmethy-Clobazam血尿120pg麦角碱尿DES血，尿1ng/ml荧光衍生化反应

用荧光衍生化试剂（也称荧光探针）与本身无荧光或荧光效率低的化合物反应，使其产物具有强荧光。从而大大提高检测灵敏度。对荧光试剂的要求主要有：

①在温和条件下，最好在水或含水介质中进行反应。

②生成物有高的荧光效率，发射光波长在较长波长处，溶剂的本底荧光不影响测定。

③反应产物极性小，易于用有机溶剂提取、分离或浓集。

④试剂反应有专属性。用于伯胺、仲胺及具有潜在胺基药物。pH8-9的水溶液，室温反应生成强荧光的吡咯啉酮衍生物。λex390nm

λem486nm。1.胺类用试剂－荧光胺（Fluorescamine）

例尿中氯氮卓可利用其水解产物三甲胺和胺荧反应

方法是：尿样中加pH7.4的磷酸盐缓冲液和NaCl固体，以异戊醇－已烷（1.5:98.5）萃取。萃取液经0.45mol/LNaOH洗涤，再以1.5mol/LHCl回提，然后水浴加热水解，NaOH中和，加入pH9.5的硼酸盐缓冲液及荧胺试剂，反应后测F值。

②丹酰氯（Dansylchloride）

用于含－NH2、－NH－、－OH、－CO－的药物分析。如：可用于测定ng水平上的吗啡、可待因、吐根等生物碱类药物。③邻苯二醛（OPA）