利玛原甲藻对腹泻性贝毒的生物合成机制

利玛原甲藻对腹泻性贝毒的生物合成机制

1常使用的毒素海洋底生甲藻是指生活在海拔高度以上的重要甲藻生态群的意义。作为国际藻类入侵的重要领域，近年来，对海洋底藻的研究越来越受国际红景观的影响（黄令风，李少军，2000）。根据研究，海洋底藻不同于浮游生物，但关于其生理和生态特征的信息很少。软马原生甲是一种广泛存在于中国海南省三亚海域的大型海域藻类，主要附着于大而恶劣的海生甲藻。它可能会产生副作用性粉质沉积物（ps），因此，柳马原甲藻成为研究底栖甲藻的热点。腹泻性贝类毒素是一类多醚类化合物,其成分主要有大田软海绵酸(Okadaicacid,OA)、鳍藻毒素(Dinophysistoxins,DTX)、扇贝毒素(Pectenotoxin,PTX)和(Yessotoxin,YTX),其中OA和DTX是导致腹泻性贝毒中毒的主要毒素类型.OA是蛋白磷酸酶PP1(ProteinPhosphatase)和PP2A(ser/threProteinPhosphatase2A)的特异性抑制剂,通过特异性地作用于蛋白磷酸酶PP1和PP2A抑制酶的去磷酸化,引起信号传导途径的变化,造成机体中毒(Svenssonetal.,2003).OA和DTX还是肿瘤促进因子,可引致DNA加合物的形成,世界范围内日趋增加的胃肠道肿瘤可能与OA和DTX1的接触有关(Garcíaetal.,2005).另外,由于OA独特的致癌作用在研究癌症机理及抗癌新药等方面具有重要价值(杨维东等,2005).同时,由于微藻培养容易控制,分离步骤相对简单,因此利用微藻制取生物毒素已成为海洋生物技术研究的热点问题(秦路平,2001).日本海洋生物工程研究公司已成功实现利用水华束丝藻制取石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)和海洋细菌生产河豚毒素.因此,研究和探讨DSP毒素生物合成机制不仅是藻毒素毒理学研究的需要,同时对于DSP的深度研发也具有重要意义.许多藻类都能够产生腹泻性贝毒,如Dinophysisacuminata、D.acuta、D.caudata、D.fortii、D.mitra、D.norvegica、D.Sacculus、ProrocentrumlimaDodge、P.concavumFukuyo、P.hoffmannianumFaust、P.maculosumFaust和P.faustiaeMorton等,但由于Dinophysisspp.的实验室培养非常困难(LawrenceandCembella,1999),因此利玛原甲藻通常可作为DSP的毒藻模型,并已成为OA、DTX1毒素标准的可靠来源(Bravoetal.,2001).许多研究指出,毒素的合成并不是藻类新陈代谢所固有的,环境因子特别是营养盐对藻毒素的生成具有很大影响(张清春等,2005;彭喜春等,2006).然而,目前有关环境因子对利玛原甲藻产毒影响的研究极少(McLachlanetal.,1994),国内则未见有关底栖甲藻产毒的报道.本文研究了利玛原甲藻不同生长期、不同营养盐条件下的生长状况和OA的生成情况,以期为进一步明确利玛原甲藻产毒机制和DSP毒素的生理学作用奠定基础,并为进一步利用利玛原甲藻制取DSP毒素提供参考和依据.2材料和方法表面活性剂2.1ccmp简介利玛原甲藻(Prorocentrumlima),由美国CCMP(Provasoli-GuillardNationalCenterforCultureofMarinePhytoplankton)提供,编号2579.2.2仪器、试药与仪器DiarrheticShellfishPoisonQuickTestKit(PanapharmLaboratoriesCo.,Ltd.Japan),海盐(Aquasonic,Ingieburn,N.S.W.,Australia),维生素VB1、维生素VB12、生物素(上海伯奥生物科技有限公司),其他试剂均为国产分析纯.CKX41型倒置生物显微镜(Olympus),CD2105型Xutemp智能生物人工气候箱(Xutemp,杭州雪中炭恒温技术有限公司),353型酶标仪(LabsystemsMultiskanMK)2.3生物细胞生长曲线的绘制实验用培养液为3.3%人工海水按照f/2培养液改良配方加营养盐配成,经0.22μm纤维滤膜除菌所得.将保存藻种接种到三角瓶中,置于温度(22±1)℃,光照强度4000lx、光暗循环为L:D=12h:12h的人工气候箱中进行扩大培养.取对数生长期利玛原甲藻,用大型藻记数板计算其细胞密度后接种,接种密度约为9.8×103个·L-1,接种后置于人工气候箱中培养.隔天于固定时间取样在倒置显微镜下观察、计数,绘制藻细胞的生长曲线.实验设置3个平行.2.4营养盐对藻细胞毒素含量的影响将利玛原甲藻在低水平N(N:P比为1.5:1)、P(N:P比为150:1)2种营养盐条件下进行培养,f/2培养液组为对照组,起始藻密度均为1.6×106个·L-1.N、P的浓度如表1所示,其他营养盐的浓度与f/2相同.取平台期藻细胞进行毒素含量的测定.2.5dsp毒素的检测分别取对数生长期前期(7d)、中期(19d)、后期和平台期(41、59和71d)的藻培养物10mL,3500rpm离心5min收集藻细胞.弃上清,藻细胞沉淀煮沸5min.加入500μL90%的甲醇和少量二氧化硅,在旋涡混合器上振荡,利用二氧化硅使细胞破壁,毒素释放溶解于甲醇中,7500rpm离心5min,取上清液,加入500μL双蒸水,混合均匀.DSP毒素的测定采用腹泻性贝毒快速检测试剂盒,该试剂盒采用抗OA的单克隆抗体,通过酶联免疫分析方法(ELISA),对OA进行专一性的检测.测定按照试剂盒说明进行.2.6统计方法数据均以平均值±标准差表示,采用t-检验进行组间差异检验.3结果和分析结果和分析3.1藻细胞衰亡期测定图1为初始藻密度为9.8×105个·L-1的利玛原甲藻生长曲线.从图中可以看出,藻细胞未出现明显的延滞期,很快进入对数生长期,45d后进入平台期,71d内未见藻细胞进入衰亡期.3.2藻细胞中ua的含量不同生长期利玛原甲藻中OA的含量如图2所示.由图2可以看出,随培养时间的推移,利玛原甲藻中OA的总体水平逐渐增加,并在平台期达到最大.单个藻细胞中OA的含量在对数前期较高,对数中期略有下降,对数末期有所增加,与对数中期相比,平台期(第59d和71d)单个藻细胞中OA的含量明显增加(p<0.05).3.3营养盐对利玛原甲藻细胞密度的影响在相同的起始密度下(1.6×106个·L-1),不同营养盐条件下利玛原甲藻的生长状况明显不同(图3).低营养盐下,利玛原甲藻生长明显比对照组差,藻细胞密度显著低于对照组,平台期藻细胞密度顺序为对照>N限制>P限制.3.4ua总含量不同营养盐条件下平台期利玛原甲藻中OA的含量如表2所示.从表2中可以看出,OA总含量从高到低依次为对照组>低N>低P;单个藻细胞中OA含量从高到低依次为低P>低N>对照组,且低N、低P两组与对照组相比有显著性差异(p<0.05).4利玛原甲藻中的毒素利玛原甲藻分布非常广泛.研究发现,利玛原甲藻的产毒有很大的个体差异,来自不同区域,甚至同一地区的不同藻株,其毒素组成和水平都不尽相同,这种差异可能缘自遗传差异,也可能源于藻生理状态上的差异.Boua觙cha等(2001)采用蛋白磷酸酶抑制法检测了利玛原甲藻不同地理株的毒素含量,发现OA含量在6261.3~128.3ng·mg-1(粗提物)之间;Nascimento等(2005)采用高效液相色谱(HPLC)对来自欧洲、北美、日本、澳大利亚、新西兰、塔希提岛和苏格兰等地区的利玛原甲藻毒素含量进行了分析,发现所有藻株均可产生OA,含量在0.4~17.1pg·cell-1,同一藻株中毒素的水平因生长期不同而有一定差异,OA含量介于2.0~12.2pg·cell-1.本研究采用快速简便的酶联免疫分析方法,对利玛原甲藻CCMP2579株毒素生成情况进行了研究.结果显示,OA含量介于91.29~110.46pg·cell-1,与Nascimento等(2005)的结果存在数量级上的差异,这可能是因测定方法或株系间差异所致.不同测定方法可导致OA检测结果差异,如Morton和Tindall(1996)利用液相色谱法和两种单克隆抗体酶联免疫吸附测定试剂盒(UBE和Rougie试剂盒)测定P.hoffmannianum和利玛原甲藻中DSP的含量时发现,3种方法对只产OA的P.hoffmannianum测定结果一致;但对利玛原甲藻DSP而言,液相色谱可以检测到OA和DTX-1的存在,检测到的毒素含量比较高;UBE试剂盒由于与DTX-1几乎没有交叉反应,检测到的毒素含量最少,比能与DTX-1发生交叉反应的Rougie试剂盒的检测值小近1倍.另外,不同株系间毒素的水平往往存在较大差异,如Touzet等(2007)研究表明,分离自爱尔兰考克港的微小亚历山大藻(Alexandriumminutum)株系的毒性比其他国家海域分离得到的株系毒性低.实验发现,利玛原甲藻中OA的总含量随生长周期的行进而逐渐提高,在平台期达到最高水平.单个藻细胞中OA含量在平台期也达到最大,但其含量的变化并非呈递增规律,而是在对数期出现一定的波动.对数中期OA含量较对数前期和对数后期低,对数中后期开始OA含量才出现递增趋势,这与Nascimento等(2005)的研究结果类似.他们的研究发现,利玛原甲藻在前25d处于对数生长期,在此期间,单个细胞OA含量在第1d最高,随后1周内逐渐下降,从第8d开始维持稳定,但对数末期OA含量开始逐渐增加,进入平台期时达到最大值.这一结果提示,藻细胞中毒素的含量可能与藻的生长状态有关.在环境适宜的条件下,藻细胞迅速分裂进入对数期,这一过程中细胞内容物会增加,OA的生物合成也在进行,但由于细胞的一分为二,内容物在两个细胞之间进行分配,使单个细胞中OA的含量维持在一定水平.进入对数生长末期后,由于细胞分裂速率降低,使OA可以在细胞中累积.细胞分裂速率越低,单位细胞中累积的OA就越多.平台期时,多数细胞停止分裂,OA含量达到最高(Faust,1991).为进一步探明利玛原甲藻的毒素合成与环境因素的关系,本研究探讨了不同营养盐条件下毒素的生成情况.结果发现,低水平的N、P抑制了利玛原甲藻的生长,这一现象与国内外许多研究结果相似.Wang和Hsieh(2002)研究发现,低N、低P均能抑制塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)CI01的生长;Touzet等(2007)的研究也表明,微小亚历山大藻在低N、低P条件下细胞生长密度较对照组明显偏低;石岩峻等(2003)研究表明,N限制可显著促进塔玛亚历山大藻细胞的分裂,低N条件下的塔玛亚历山大藻最先进入对数期,然后依次是中N和高N条件.由于在藻细胞的生长后期,N缺乏对生物量的积累是不利的,因而低N下生物量明显偏低;低P对塔玛亚历山大藻的生长也是不利的,不但细胞分裂缓慢,而且生物量低.毒素的合成并不是藻类新陈代谢所固有的,一般认为是压制或清除其它藻类竞争者,在生存中获得竞争优势的一种策略(彭喜春等,2006).许多研究表明,环境胁迫条件下,次生代谢物的合成是增加的,Johansson和Granéli(1999)研究表明,N、P限制条件下小定鞭藻(Prymnesiumparvum)的溶血活性明显增加;Boyer等(1987)研究发现,低P条件下塔玛原膝沟藻(Protoaunyanlaxtamarensis)在平台期毒素含量比对照组高3到4倍.与此观点一致,本实验对利玛原甲藻在N、P限制条件下的生长及产毒情况进行的研究发现,与对照相比,低N、P条件下(采用f/2培养基),利玛原甲藻的细胞生长密度受到明显抑制,平台期藻细胞生长密度和OA总含量为对照组>N限制组>P限制组,但单个细胞产毒水平却与之相反,从高到低依次为P限制组>N限制组>对照组,这可能是由于环境条件的限制,促使利玛原甲藻产毒以减小不利生态条件带来的损害,因此DSP的合成与