腹泻性贝毒的危害与防治

腹泻性贝毒的危害与防治

近年来，随着药物红色高峰的发生，这对中国的海洋生态和渔业造成了重大影响。赤潮毒素严重威胁了海洋养殖和人类健康。腹泻性贝毒(DiarrheticShellfishPoisoning,DSP)是由有毒赤潮藻类鳍藻属(Dinophysis)和原甲藻属(Prorocentrum)产生的一类脂溶性多环醚类天然化合物,主要成分是软海绵酸(OkadaicAcid,OA)及其衍生物,能引起食用者腹泻、恶心等。腹泻性贝毒能激发磷酸化来控制大肠细胞内钠的分泌,是蛋白磷酸酶PP1A和PP2A的强烈抑制剂,也是一种很强的促癌剂,能引起消化道肿瘤的发生。我国海产品特别是贝类受腹泻性贝毒沾污越来越严重。目前,腹泻性贝毒的分析方法主要有小鼠生物法、高效液相色谱法以及一些免疫化学方法。小鼠生物法简便易行,适合于大规模、批量样品的检测,但不能区别毒素的种类和结构,干扰大、不精确。高效液相色谱法(HPLC),特别是液-质联用技术,可准确分析毒素的含量和种类,检出限可低至ng/g,但样品前处理繁琐费时,且仪器昂贵。因此,建立快速、灵敏的赤潮毒素检测方法,有利于开展大规模水产养殖区和生物样品监测计划,对推动贝类毒素研究和保障人体健康十分重要。免疫化学方法是基于抗体对抗原的特异性结合的一种分析方法,具有灵敏度高,特异性强,仪器设备简单,方法易掌握,样品前处理相对简单等优点,适于现场监测和大量样本快速筛查,因而,近年在分析化学领域受到极大的重视且发展迅速。现已有售德国、日本等公司生产的ELISA检测DSP的试剂盒。国内已有关于OA抗体制备和ELISA检测方法的报道,有关腹泻性贝毒胶体金检测方法的研究也有报道。国内尚未见应用免疫层析技术用于分析DSP的报道。本文用胶体金标记抗体,通过竞争免疫反应,研制快速检测OA的免疫层析试纸条技术,为我国腹泻性贝毒监测提供快速分析方法。1实验部分1.1刀、玻璃器饼、试纸条模具BIODOT切割机,XYZ-3000喷点仪购自Biodot公司;JASCOV-550紫外/可见分光光度计;恒温干燥箱、真空干燥箱、切刀、玻璃器皿、试纸条模具均为国产。胶体金检测用样本垫(玻璃纤维素膜,10×300mm)、胶金垫(玻璃纤维素膜,8×300mm)、吸水纸(14×300mm)均购自Millipore公司;硝酸纤维素膜(NC膜,25×300mm)购自Sartorius公司。40nm胶体金,用1%柠檬酸三钠水溶液烧制还原0.01%氯金酸水溶液,批量制备紫红色的胶体金溶液,最大吸收波长538nm,其它试剂均为分析纯。1.3抗体标记的确定1.3.1抗软海绵酸单克隆抗体及包被抗原的制备本室自制OA-OVA偶联抗原(4.65mg/mL)和抗OA-KLH单克隆抗体腹水,制备方法和性质鉴定见参考文献。1.3.2单克隆抗体腹水的纯化用辛酸硫酸胺方法纯化得到粗抗体,再用0.01mmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)透析4～5d。用分光光度计测得抗体蛋白浓度为1.78mg/mL。1.3.3包被抗原浓度筛选OA-OVA偶联抗原用PBS稀释,稀释倍数分别为原液、稀释2倍、稀释4倍,稀释后点在NC膜上,37℃干燥1h备用。抗原喷NC膜:抗原用PBS稀释4倍后用XYZ-3000喷点仪喷NC膜,喷量为:0.74μL/cm,Y=16cm,37℃干燥过夜,备用。1.3.4金标抗体的制备抗体标记量为20μg/mL。先取20mL40nm的胶体金于干净的烧杯中,用1mmol/L的NaOH调节其pH值为8.2,加入抗体,使其在胶体金中浓度为20μg/mL,搅拌1h,加入胶体金1/10体积的10%牛血清白蛋白溶液,搅拌30min,5000r/min离心30min,取沉淀,用PBS复溶,约加入4mL缓冲液,用紫外分光光度计扫描胶体金特征吸收峰,确定胶体金OD值后用PBS缓冲液稀释,使其OD值为5,分成100μL/管,插入点好各种抗原浓度的NC膜,观察NC膜显色情况,确定用稀释4倍的抗原筛选抗体标记浓度。抗体标记量的选择:按照金标抗体的制备方法,标记不同浓度的抗体量,分别为20、15、10、5μg/mL,配制适当浓度,使其OD值为5,用XYZ-3000喷点仪将金标抗体喷在胶金垫上,喷金量分别为10、8、6、4μL/cm,真空干燥2h,备用,抗体共计16个梯度条件。1.3.5贝类样品处理方法贝类样品的测定:取新鲜的扇贝,去壳,匀浆,取少许匀浆,加入OA标准品,使其含量为20μg/100g,取加标匀浆,用4倍体积(m∶V=1∶4)的80%甲醇-水超声萃取5min,离心,上清液用PBS稀释3倍,在96孔加样板上,加80μL/孔,另加80μL/孔PBS为对照。2结果与讨论2.1金标抗体条件和标准品溶液的选择腹泻性贝毒免疫层析快速检测技术应用了竞争抑制免疫层析的原理,样本中软海绵酸OA在流动过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合,抑制了抗体和NC膜检测线上OA-OVA偶联抗原的结合。如果样本中OA含量大于12ng/mL,检测线不显颜色,结果为阳性;反之,检测线显红色,结果为阴性。16个抗体条件的金垫,分别和稀释4倍的NC膜组装成试纸条,用PBS检验显色程度。结果显色均很深。降低抗体标记量,用稀释4倍的NC膜检测和调节抗体标记量,经过细微摸索抗原浓度,最后确定用PBS稀释8倍的检测抗原制备NC膜,0.74μL/cm。降低标记量为5、4、3、2μg/mL,调制OD值为4、5、6,喷金量为2、2.5、3、3.5、4、6、8μL/cm,共84个金标抗体条件和稀释8倍的包被抗原NC膜组装,分别用空白(0.01mmol/LPBS)、PBS稀释的软海绵酸OA标准品20、15、12、10ng/mL检测显色程度和阳性抑制浓度。加样量为80μL/孔,判断时间为15min。最终选择标记量为:2μg/mL,OD为5,喷3μL/cm,组装双金垫,NC膜为原液稀释8倍的抗原条件组装成试纸条,检出限为12ng/mL。重复性实验:按照上述实验条件,重新标记抗体并喷抗原,组装条件一致的试纸条,检测结果和原条件实验一致(图1),空白液显色一般(0号卡),阳性12ng/mL完全抑制无条带出现(8号卡)。贝类DSP毒素提取需要80%的甲醇-水溶液,有机溶剂会干扰抗原抗体反应,因此在PBS缓冲液中添加不同浓度甲醇实验,结果表明:检测样本中含30%以下甲醇对免疫学反应无影响。小鼠法阴性样品验证了此结果(图2)。小鼠法阳性样品有部分抑制,条带颜色比空白浅(图3)。对于加标贝样萃取液的测定结果表明,15min内空白对照显红色条带,而贝样的萃取液(含OA16.7ng/mL)无颜色条带出现。当贝类匀浆用5倍体积的80%甲醇-水萃取时(含OA13.3ng/mL),实验结果在15min内无颜色条带出现,但放置长时间(大于2h)后,会出现极浅的条带印迹。因此对于OA含量稍高于或接近于检出限12ng/mL的样品,一定要严格控制检测时间,在15min内,与空白对照,得出结果,当时间过长,可能会由于极少量的金标抗体抗原复合物的长时间附着积累,以及其他一些非特异性吸附反应等的作用,而干扰试验结果的判断。2.2等价物测定一些国家规定的贝类组织中腹泻性贝毒安全阈值是20μgOA等价物/100g贝肉,我国《有毒赤潮监测崭行规范》推荐20μgOA等价物/100g贝肉的限定值。应用研制的灵敏专一的抗软海绵酸单克隆抗体,研究建立的贝类腹泻性贝毒主要成份软海绵酸的免疫快速检测卡(检出限12ng/mL,时间15min),不需要任何仪器设备,完全满足该规定阈值,应用于贝类样品中软海绵酸的检测。2.3联免疫检测方法免疫层析与酶联免疫分析方法具有相似的原理,都是基于抗原抗体的特异性结合反应而建立的免疫检测技术。使用同一种抗体建立的酶联免疫检测方法比免疫层析检测方法灵敏度高,但分析步骤多,反应时间长(2.5h),定量检测需使用酶标仪完成;而免疫层析快速检测方法虽然灵敏度低,但只使用一种试剂,一步操作,可在室温长期保存,具有简单、快速、准确、无污染、不需任何检测仪器的优点,特别适用于现场监测筛选阳性样品,然后使用色谱等仪器方法验证鉴定。对于半定量的快速现场筛选具有其他方法不可比拟的优点。2.4检测方法的选择本研究组曾制备抗OA-BSA单克隆抗体,由于特异性不高,最大抑制率只有30%,建立的免疫层析检测方法灵敏度低,不具有可用于实际样品检测的使用价值;而本研究中使用的抗OA-KLH单克隆抗体,特异性高,最大抑制率可达到90%以上,因此使用其建立的免疫层析检测方法灵敏度高,能够满足实际样品安全规定值的检测需要,建立的分析方法具有实用价值。结合率高的包被抗原。因为OA是小分子,不能直接吸附到硝酸纤维膜上,必需偶联到大分子蛋白载体上。偶联的分子比是影响检测方法成功的关键因素之一。喷点在检测线上的包被抗原OA-OVA,必需具有较高的OA结合比,才能够使得竞争结合的金标记抗体的量能够产生肉眼可识别的颜色变化,而达到检测的目的。建立一种物质的胶体金免疫层析快速检测方法的影响因素非常多。尽管在理论上已经很成熟,可实际中成功率并不高,尤其对于小分子的间接竞争方法,困难更多。这是一个复杂的实验过程,涉及到