高效薄层色谱HPTLC-

11仪器分析供药学类、中药学类、制药工程及相关专业使用全国普通高等中医药院校药学类专业“十三五”规划教材（第二轮规划教材）22第十二章经典液相色谱法（LC）3经典液相色谱法

LC31.平面色谱法概述4平面色谱法基本原理薄层色谱法纸色谱法第六节

平面色谱法4平面色谱法是指固定相呈平面状态的色谱法。平面色谱法与柱色谱法的分离机理基本相同，操作方式有所区别。经典柱色谱法的固定相填充于柱管中，流动相靠重力作用流经固定相，分离过程称为洗脱，流动相也称洗脱剂；而平面色谱固定相涂布于平面载板上或以纸纤维为平面载体，流动相通过毛细作用流经固定相，分离过程称为展开，流动相也称展开剂。本节主要介绍薄层色谱5

法与纸色谱法。5一、平面色谱法概述二、平面色谱基本原理·1.比移值（retardation

factor；Rff））图1

2-8平面色谱展开示意图实际操作中，待测组分Rf

在0.2

~

0.8为宜。2.Rf与k的关系667·

可见Rf即柱色谱中的保留比R。7·

组分的k↑，在薄层上移动速度↓，Rf

↓。若组分k为0，其Rf

=1，表示该组分完全不被固定相保留；若k为无穷大，其Rf=0，表示该组分在流动相中浓度为0，完全被固定相保留，停留在原点，不能被展开。3.影响Rf值的因素影响最大的是固定相、流动相、组分的性质及温度等，此外，当用同一种固定相、流动相系统时，被测物质Rf

值还受下列因素的影响：：①固定相厚度。②展开距离。③展开容器中展开剂蒸汽的饱和程度。④样品量。⑤操作时的环境湿度和吸附剂含水量。4.相对比值（relative

retardation

factor，Rst）Rst是在一定条件下，待测组分比移值（Rf(i)）与参考物质比移值（R

)）之比：f(s·

式中，Li，Ls分别为原点至待测组分i和参考物质s斑点中心距离。Rst与Rf相比具有更好重现性和可比性。参考物质可以选择纯物质加到试样中，也8

可以是试样中的某一已知组分。Rst可以大于1，也可以小于1。89三、薄层色谱9固定相涂布于平面载板上，流动相通常是借毛细管作用流经固定相，使被分离后的物质保留在固定相上。—开放式的离线操作。见图示特点适用于微量分析（微克级）；仪器简单，操作方便，灵敏度高，分析快速；具有多路柱效应，可同时平行分离多个样品；分离样品所需展开剂少，节约溶剂，减少了污染薄层色谱（TLC）nextback（一）概述．定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板 上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法．操作过程：见图示铺板→活化→点样→展开→定位(定性)/洗脱(定量)3．分类：分离机制吸附、分配、离子交换、空间排阻经典薄层色谱（TLC）、高效11

薄层色谱（HPTLC）、胶束薄层色谱（MTLC）next111212（二）吸附剂的选择13根据被测物极性和吸附剂的吸附能力被测物极性强——活性低的吸附剂被测物极性弱——活性高的吸附剂选择吸附剂主要依据样品的性质如：极性、酸碱性、溶解度等氧化铝一般适用于碱性和中性物质的分离硅胶微带酸性适用于酸性和中性物质的分离13（三）展开剂的选择剂14141、原则：要同时考虑固定相、流动相、被分离物质的性质。2、选择合适的Rf值（据展开剂极性）3、选择较好的选择性（据溶的三角形分类）4、防止展开剂脱混易脱混：多元溶剂极性差别大，极性溶剂比例小5、多元溶剂系统展开剂不可重复使用图示back（四）TLC的实验操作1s制板固定相：硅胶(硅胶Hs硅胶Gs硅胶GF254)sAl2O3s素s聚酰胺s葡聚糖凝胶s硅藻土等载板：软板(聚酯薄膜)s硬板(玻璃板)粘合剂：CMC-Na

0.3～1%，常用0.5%铺板方法

倾注法s浸渍法s机械涂布（自动s手动）（图示）s喷涂法TLP的干燥:先自然干燥，后烘干活化

自然干燥时要阴干，否则吸附剂外孔间大量溶剂急剧挥发，溢出薄层面破坏表面平整，或由于突然受热引起薄层局部收缩龟裂。板的厚度分析用：0.3～1mm；制备用:1～2mm٭back预制板18定性分析—窄条定量分析—10×20cm硅胶G：自含粘和剂硅胶H：不含粘和剂，铺板时另加入CMC硅胶HF254：含荧光剂，254

nm紫外光照发绿光硅胶HF365：含荧光剂，18

365

nm紫外光照发光表11-3192、点样（1）控制点样量，防止拖尾1-10μL·

点样量=样品溶液浓度×点样体积（2）控制斑点大小：一般在2～3mm193、展开（1）饱和展开饱和展开箱展开是指在展开前，箱内的各种气液达到平衡（和），展开过程中，薄层上的溶剂不再蒸发，重现性好。（2）不饱和展开不饱和展开箱展开是指展开箱中气体与溶剂蒸气、薄层未达动态平衡时即开始展开；展开过程中，薄层上的溶剂不断地薄层表面上蒸发，从而造成结果重现性差及边缘效应边缘效应：即同一种组分在同一块板上，处于边缘的点的Rf值大于中心点。

原因：a、边缘处溶剂挥发快；b、多元溶剂时，易挥发溶剂在边缘挥发快，从而难挥发溶剂（极性大）相对比例大洗脱能力强，使斑点移动快。（3）展开方式上行法、下行法、水平展开。（4）特殊展开技术连续展开（相当于增加展开距离）单向多级展开双向展开分级展开（自动多步展开仪）2121·

4、检出显色、定位22有色物质直接定位。无色物质紫外光下定位（λ254，365）。荧光定位：发射荧光的物质在荧光背景下显暗斑的物质（荧光熄灭）显色定位（化学显色）I2蒸气（棕黄色）浓硫酸/MeOH（1:1）或10%H2SO4-乙醇溶液喷雾后，110℃烘烤22专属显色剂喷雾：人工、机械（五）定性分析1、比移值Rf、R（保留比）R’=

1 /（1+CsVs

/

CmVm）=1 /（1+KVs

/

Vm）Rst相对比移值图12-8平面色谱展开示意图比移值Rf、R影响因素24色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为。k大，则移动慢，比移值小,Rf↓；正相薄层板，对于极性组分v

展开剂极性↑大，Rf↑大（容易洗脱）v

展开剂极性↓小，Rf↓小（不容易洗脱）Rf范围：0<Rf

<1（组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离）24Rf

=0.2～0.8（常用）；0.3～0.5（最佳）2、流动相的速率25与柱色谱相比，TLC、PC中，流动相的速率是不恒定的，展距越大，速率越小。3、固定相的变化平面色谱操作大多是敞开的，与大气接触，与柱色谱不同。在上样时，吸附薄层会吸收空气中的水或减活，从而造成结果不重现。25定性26Rf值定性影响Rf值的因素：饱合程度、湿度、温度多种溶剂系统定性改变：a、极性b、酸碱性c、种类（组别）

d、正向、反相色谱26（六）定量27直接测定目测斑点面积薄层扫描TLCS间接测定（洗脱测定）分离后刮下相应的固定相，用溶剂将组分洗下，进行紫外测定27。（七）薄层扫描法（

TLCS）28薄层扫描法基本原理:样品经薄层分离后直接测定或经适当处理使之显色或产生荧光，在特定波长下，用光度计测其吸光度或荧光强度的方法称为薄层扫描法。薄层扫描仪测定方法：吸收测定法（UV-Vis）、荧光测定法281、吸收测定法29利用可见光或紫外光照射展开后的薄层，测定色谱斑点的吸光度A随展开距离L的变化，得到A-L或A-Rf

曲线，即薄层扫描图。色谱峰面积，可用于定量分析。由于薄层板存在明显的散射和反射现象，所以斑点中组分浓度与A的关系不服从Beer定律，需要Kubelka-munk理论来描述。理想空白薄层板的单位薄层厚度的吸光系数K=0，实际上，K≠0，为消除此影响，以空白板为基准，测定空白透光率或反射率来计算2斑9

点的吸光度。·

透射法透光率：A=-lgT/T0空白板和斑点·

反射法（常用）空白板和斑点T0=i0/I0

；

T=i/I0反30射率：A=-lgR/R0R0=j0/I0；R=j/I0302、荧光测定法31荧光：某些物质吸收特定波长的光后，除产生吸收光谱外，还会发射比原来吸收波长更长的光。灵敏度高，但适用范围窄，要求组分发射荧光（衍生）F=ФI0

abcI0：入射光强度

b：薄层厚度Ф：荧光效率a：吸光系数31c：样品浓度323、扫描方式32直线形扫描：光束以直线轨迹通过色斑，光束应将整个色斑包括在内。适用于外形规则的斑点。锯齿形扫描：光束呈锯齿状轨迹移动。适用于外形不规则及大的色斑。4、定量方法外标法外标一点法外标两点法2）内标法33331、高效薄层色谱（HPTLC）固定相粒度：5～10μm分离度高、灵敏度高、展开时间短经典薄层板与高效薄层板的比较经典薄层高效薄层点样体积1～5μl100～500nl溶液浓度0.01～1.00%原点直径5mm(3mm3m4)1～2mm起始线距底边距离1.5cm1cm展距10～15cm5～7cm点与点间距1～2cm0.5cm固定相颗粒直径10～40μ3m4(20μm)5～10μm(7μm)（八）特殊薄层色谱法2、胶束薄层色谱

当表面活性剂水溶液超过一定浓度（临界胶束浓度CMC）时，多余的表面活性剂不再溶解，而聚集成胶束，成为胶体分散体系；由于被分离物质在水、胶束、固定相三者之间相互作用（分配系数、静电作用、空间效应等）而具有很好的选择性。

作为流动相的表面活性剂，具有疏水基和亲水基团，在水溶液中，其分子可聚集在一起，形成亲水基向外、疏水基向内（或相反）的缔合体，即胶束。胶束的存在能使不溶或微溶于水的有机化合物的溶解度增加

流动相用低浓度表面活性剂的水溶液或含有少量水的非极性有机溶液固定相：多用聚酰胺板或薄膜；其次为氧化铝，硅胶板较少应用表面活性剂：阴离子：十二烷基硫酸钠（SDS）

阳离子：十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）两性：十八烷基二甲基甜菜碱；十二烷基氨基丙酸钠以滤纸做载体，以构成滤纸的纤维素所结合水分为固定液，以有机溶剂为展开剂的色谱分析方法。固定相：纸纤维吸附的水流动相：有机溶剂（乙醇、丙醇、丙酮）或水讨论：Rf

与组分性质、流动相及溶解度有关：36极性组分→易保留，Rf小（流动相极性↑，Rf

）36非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf