白纹伊蚊湛江种群对溴氰菊酯的抗药性及酶活力分析

白纹伊蚊湛江种群对溴氰菊酯的抗药性及酶活力分析

白脸蚊是中国的主要传播手段，白脸蚊是中国的主要传播手段。广东地区是登革热暴发流行的高风险区,且登革热主要由白纹伊蚊传播。近10年来,随着全球变暖加剧,人口持续增长,国际间的旅行、劳务和贸易往来更加频繁,登革热在全世界的发病率升高了近30倍,已成为全球关注的重要公共卫生问题。湛江市位于广东省南部,上世纪80年代初期和中期曾经发生过2次登革热的大暴发。2007年9-11月,发生登革热的本地暴发流行,报告本地感染205例。为了预防控制登革热的暴发流行,该地区加强了媒介蚊虫的监测与控制力度,同时也增加了杀虫剂对媒介伊蚊的选择压力。目前,因登革热预防控制尚无有效疫苗,其防治主要依赖于媒介蚊虫的预防控制。长期以来,我国在登革热疫区的媒介蚊虫控制中,以化学防治成蚊为主[粤卫(2007)31号文件]。由于频繁和大量使用化学杀虫剂,我国有多个地区已出现白纹伊蚊对杀虫剂产生抗药性的报道,蔡松武等、李成玲等对广东省广州、汕头、深圳、韶关市等进行白纹伊蚊抗药性调查,结果显示,该蚊对高效氯氰菊酯、溴氰菊酯已经产生抗性。代谢酶活力增加,是很多昆虫对常用拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性的主要机制之一,针对蚊虫抗药性与代谢酶活力的关系研究,也有一些报道。然而,我国白纹伊蚊的抗药性机制研究较少,为保护卫生杀虫剂资源,研究抗药性治理策略,探索白纹伊蚊的抗性机制,我们于2012年在广东省湛江地区采集白纹伊蚊,测定了其成蚊对溴氰菊酯的抗药性水平,并探讨了该种群代谢酶的活性及其变化特征。1材料和方法1.1测定抗药性用文品92.5%溴氰菊酯原药,为本实验室提供的全国重要病媒生物抗药性监测用标准品。测定用药膜根据1979年刘维德介绍的WHO方法制作。测定药膜浓度参照靳建超方法确定。1.2化学试剂与仪器多功能氧化酶(MFO)测定:TMBZ(amresco,313.3)、30%H2O2、细胞色素C(cytc)(牛心,genta);非特异性酯酶(NSE)测定:α-乙酸萘酯(α-NA)、α-乙酸萘酚(sigma)、固蓝B盐(fastblueBsalt)(Fluka产品);谷胱甘肽转移酶(GST)测定:1-氯-2,4二硝基苯(CDNB)、还原型谷胱甘肽(GSH)(sigma进口分装);磷酸缓冲液(PBS)均为0.05mol/LpH7.2,由购自上海生工生物工程技术有限公司powdered配制而成;其他化学试剂均为分析纯。成蚊接触筒(马来西亚WHO合作中心);酶标仪(Infinite200-PRO);5~50μl排枪(RAININXLS)和300μl排枪(eppendorf);96孔微量滴定板(costar3590);电动组织研磨器(天根ose-Y10)等。1.3测试虫1.3.1伊蚊实验室品系引自江苏省疾病预防控制中心(CDC)的白纹伊蚊实验室品系,在未接触任何杀虫剂的情况下饲养多年。蚊虫饲养条件:温度(26±1)℃,相对湿度(75±5)%,光照14H∶10D。1.3.2野外种群多样性广东省CDC提供,于2012年8月采自广东省湛江市霞山区(21°11′53.22″N,110°24′33.23″E)的野外种群。其孳生环境为居民区外环境废弃的小盆罐积水。在本实验室上述饲养条件下,饲养至第2代进行成蚊生物及生化测定。1.4蚊的确定及饲养成蚊对溴氰菊酯的敏感性测定采用WHO推荐的接触筒法。将0.02%溴氰菊酯药膜固定于接触筒中,将20只3~5日龄雌成蚊放于恢复筒中,剔除不健康试虫后,转移至接触筒,并水平放置接触1h,再转移至恢复筒中,于人工气候培养箱饲养(温度26℃,相对湿度75%,光周期14L∶10D),24h后记录死亡数。因白纹伊蚊接触溴氰菊酯药膜24h后,蚊虫的活态与死态分明,将身体不动者判定为死亡。1.5代谢酶的生物化学参照Polson等、Brogdon和Barber的方法,利用酶标仪对MFO、NSE和GST进行测定。1.5.1min致死在养蚊笼中,用塑料吸蚊管取3~5日龄约30只雌成蚊,于-80℃冰箱冻存5~10min致死。在冰盘上取单只蚊虫于1.5ml离心管中,加入0.1mlPBS缓冲液,用电动组织研磨器匀浆约20s后,补加0.4mlPBS缓冲液后,4℃条件下15000×g,离心15min,取上清液作酶源。1.5.2醋酸钠缓冲液s1向酶标板中分别加入100μl酶液、200μlTMBZ溶液(2mgTMBS∶1ml甲醇∶5ml0.25mol/LpH5.0的醋酸钠缓冲液),25μl3%H2O2。室温反应5min,测定A650。用标准品获得细胞色素c标准曲线,根据方程求得酶反应体系中细胞色素c的含量,酶活力单位用“nmolcytc/mgpr”表示。1.5.3酶活的总酚含量的测定向酶标板中分别加入100μl酶液、100μlα-乙酸萘酯溶液(14mgα-乙酸萘酯∶5ml丙酮∶20mlPBS缓冲液),室温下反应15min,加入100μl浓度为1mg/ml固蓝溶液(PBS)终止反应,再放置4min后,测定A620。用α-乙酸萘酚标准品获得其标准曲线,根据方程求解酶反应体系中生成的α-乙酸萘酚量。酶活力单位用“nmolα-乙酸萘酯/(min·mgpr)”表示。1.5.4有关“s”b3取100μl酶液分别加入酶标板各孔中,同时加入100μl浓度为0.61mg/mlGSH溶液(PBS)和100μlCDNB溶液(2mgCDNB∶1ml丙酮∶9mlPBS缓冲液),即刻测定A340,室温放置10min后再次测定A340。用CDNB的消光系数extinctioncoefficient(e=9.6mmol/L)将A值转化成酶比活力[nmol/(min·mgpr)]。1.6数据的统计与分析1.6.1酶活性计算式中,cytc表示细胞色素c,pr表示每只测定蚊虫的酶液制备后样品的酶液浓度。1.6.2w、gst酶活力测定用SPSS20.0软件对资料首先进行正态性检验(Kolmogorov-Smirnov),再进行WilcoxomW检验,不同种群间MFO、NSE、GST酶活力差异分析,以及同一种群内3种代谢酶活力与蛋白质浓度的相关性检验(正态分布资料使用Pearson检验,非正态资料使用Spearman)。所有图表制作都使用SPSS20.0软件。2结果2.1zj种群成蚊用0.02%的溴氰菊酯为诊断剂量,参考WHO对按蚊抗性的判断标准,ZJ种群成蚊已经产生高抗。而与之相比,LAB对溴氰菊酯处于敏感水平,死亡率为98.46%,二者的死亡率差异较大,接近80%(表1),因此可以作为抗药性代谢酶研究的参考品系。2.2对溴氰菊酯mfo、nse、gst的活性ZJ种群成蚊的MFO、NSE、GST活性分别为(1.97±1.16)nmolcytc/mgpr、(35.91±22.48)nmolα-乙酸萘酯/(min·mgpr)和(17.91±8.05)nmol/(min·mgpr),与LAB相比都有显著升高,分别是LAB的1.67、1.91和1.96倍(表2),经WilcoxomW检验,2个种群的MFO、NSE、GST酶活力差异均有统计学意义(P<0.05)。可见,ZJ种群对溴氰菊酯的抗药性产生过程中,代谢酶起到一定作用。对于MFO、GST和NSE酶活力,ZJ种群的种内差均>LAB,ZJ种群的GST酶活力均值水平几乎为LAB的2倍,ZJ种群的NSE种内差异约为LAB的5倍。表明NSE和GST在广东省ZJ种群的白纹伊蚊中已经有很大变化,如果存在持续的杀虫剂选择压力,这种差异会在种群中更加明显地表现出来。而MFO在2个种群中相对比较集中。可见,在湛江野外种群中,抗药性的产生MFO的变化不大(图1)。2.3zj和la的gst活力差异ZJ种群的MFO活力呈正偏态分布,与LAB相比酶活力变化范围较大;LAB白纹伊蚊基本呈正态分布。ZJ种群的NSE活力呈现正偏态分布,LAB则呈正态分布(图2)。图2显示,ZJ种群GST活力呈现正偏态分布,但是偏度极小,仅为0.2,可能该酶活力的变化处于相对稳定的平台期;LAB的GST活力呈正态分布。总之,湛江白纹伊蚊的3种代谢酶均呈现正偏态分布,一定程度上说明它们均处于上升阶段,即该种群处于抗性发展过程中。2.4zj种群的遗传多样性与酶活力白纹伊蚊ZJ种群和LAB的3种代谢酶活力与蚊虫个体的蛋白质含量(每只蚊虫500μl匀浆后的浓度),用Pearson(正态数据资料)或Spearman(非正态数据资料)进行相关性检验,结果表明二者间存在极显著的负相关性(P<0.01),ZJ种群的相关系数(r)=-0.77,LABr=-0.73(图3A)。而ZJ种群和LAB的NSE、GST与个体的蛋白质含量间无相关性(P>0.05)(图3B、C)。用LAB的酶活力均值和方差(ue0af±1.96s),计算3种代谢酶活力的95%参考范围,结果MFO为0.12~2.54nmolcytc/mgpr,NSE为10.66~28.37nmolα-乙酸萘酯/(min·mgpr),GST为3.63~16.06nmol/(min·mgpr)。以各上限值为抗性个体判断指标,评估种群中的抗性个体百分率。由表3可见,ZJ种群白纹伊蚊成蚊对MFO、NSE和GST单一酶种产生抗性的个体分别占27.91%、59.76%和72.73%;对NSE和GST、MFO和GST以及MFO和NSE同时产生抗性的个体分别占44.16%、24.68%和18.29%;已有15.58%的个体对3种代谢酶都产生抗性。3抗药性菌株活性ZJ种群白纹伊蚊成蚊与实验室敏感种群成蚊相比个体较小,同时试验中对样品的蛋白质含量测定也发现,LAB种群雌成蚊的蛋白质含量是ZJ种群的1.5倍。本研究结果显示,ZJ种群蚊虫的MFO、NSE和EST的酶活力与敏感品系相比分别是1.67、1.91和1.96倍,且MFO酶活力与蚊虫的蛋白质含量呈负相关,而NSE、GST的酶活力与蚊虫蛋白质含量无关,表明ZJ种群蚊虫MFO的酶活力与蚊虫个体大小有关,而NSE、GST的酶活力与蚊虫个体大小无关。在白纹伊蚊的ZJ种群中,NSE和GST的酶活力升高可能是其对溴氰菊酯产生高抗的主要机制。吴家红等针对白纹伊蚊实验室溴氰菊酯抗性品系的幼虫研究,发现尽管其生物测定的抗药倍数已经高达480倍,但是其GST和NSE活性与敏感品系相比仅略有升高,分别是1.29倍和1.12倍。而用PBO抑制后对幼虫增效显著,显示出MFO是主要抗药性机制。而本研究是针对具有高抗水平的白纹伊蚊野外种群成蚊代谢酶进行的研究,且其MFO的活力增加仅为实验室敏感品系的1.67倍。可见,实验室选育的溴氰菊酯抗药性品系与野外对其产生抗药性的机制不同。导致两个种群产生如此巨大差异的原因,有待进一步研究。ZJ种群内的个体差异较大,可见该种群的抗性处于快速变化阶段,还未呈现稳定态势。一方面说明这是抗药性快速上升的阶段,另一方面也可以利用这个时期种群内抗药性的不稳定性及时进行抗药性治理。溴氰菊酯是一种广谱、高效杀虫剂,也广泛应