盐酸米托脂质体的制备及抗肿瘤作用研究

盐酸米托脂质体的制备及抗肿瘤作用研究

盐酸米托是一种环类广谱抗肿瘤药物。其作用机制是在dna碱基之间嵌入二甲基，阻止dna的合成和复制，导致dna链的连接和结构破坏。此外米托蒽醌还能够干扰RNA的合成,并且还是拓扑异构酶Ⅱ的有效抑制剂,从而导致基因组DNA的崩解。米托蒽醌属于细胞周期非特异性药物,其对肿瘤细胞没有选择性,因此具有明显的毒性,其中最为严重的是心脏毒性。在临床使用过程中,其心脏毒性随着累积剂量的增加而增大,患者在治疗过程中或治疗结束数月或数年后都有可能发生充血性心力衰竭。脂质体作为抗肿瘤药物的载体,可以减少药物在正常组织的分布,增加药物在肿瘤组织的蓄积,从而降低药物毒性、改善药物的治疗指数。为了提高米托蒽醌的治疗指数,许多研究小组试图开发其脂质体制剂。美国Neopharm公司采用被动载药技术开发米托蒽醌脂质体制剂,他们在磷脂的双分子层中添加荷负电的心磷脂,由于心磷脂可以和米托蒽醌强烈相互作用,因此米托蒽醌可以包裹于磷脂双分子层中。临床前研究表明,得到的处方安全性有所提高,但是对于疗效的改善不是很明显。一期临床研究则发现,脂质体药物和游离药物相比,可以显著增加偶发性感染的几率。出于安全性的考虑,该产品被停止研发。加拿大INEX公司的脂质体研究小组则采用主动载药技术(pH梯度法)开发米托蒽醌脂质体制剂,在他们的研究中,使用DSPC和胆固醇作为磷脂双层,300mmol·L-1的柠檬酸梯度进行载药,脂质体的粒度在100nm左右,结果发现制备得到的脂质体处方,其抗肿瘤效果不如游离的米托蒽醌。为了改善脂质体的治疗效果,最终他们把磷脂双层的组成改为DMPC和胆固醇,得到了治疗指数改善的处方。但是由于DMPC的相转变温度在21℃左右,在储存期内药物的渗漏有可能增加,处方会不稳定,因此该处方最终也被放弃。此外,蛋白受体靶向脂质体、叶酸靶向脂质体等高端米托蒽醌脂质体制剂也在研究中。本实验采用铜离子梯度法制备了米托蒽醌脂质体(Mit-lipo),考察了其放置稳定性,并与米托蒽醌游离药(Mit-free)的药动学、药效学进行了对比研究。1实验动物的分离和鉴定R-211旋转蒸发仪(香港步琪公司);NanoS90绿光粒度测定仪(美国马尔文公司);Waters2690液相系统(美国Waters公司);TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂);盐酸米托蒽醌(重庆凯林公司,批号M20070104);氢化大豆卵磷脂(HSPC,德国Lipoid公司,批号256205-1);胆固醇(西安力邦制药有限公司,批号20060406);三氯甲烷,硫酸铜,氯化铜,组氨酸,异丙醇,蔗糖,三乙胺);庚烷磺酸钠;甲醇,乙腈为色谱纯;RPMI1640培基(Sigma公司);胎牛血清(Gibco公司);5%葡萄糖注射液(石家庄四药有限公司);小鼠L1210细胞株(中科院上海生命科学研究院细胞资源中心);清洁级昆明小鼠(河北省实验动物中心,实验动物生产许可证号SCXK[冀]2008-1-003);BDF1小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号SCXK[京]2006-0009)。2方法和结果2.1脂质体离子梯度的制备将质量比3∶1的HSPC和胆固醇溶于氯仿中,置于旋转蒸发器中,减压回收氯仿成膜。加入0.3mol·L-1铜盐内相溶液,旋转将膜洗下并水化一定时间。采用高压挤出设备将空白脂质体整粒,之后通过透析以蔗糖/组氨酸溶液替换脂质体外的铜离子溶液,从而使脂膜内外形成离子梯度。将药物水溶液与脂质体混悬液混合孵育,即得米托蒽醌脂质体。2.2正交实验结果根据单因素考察和预实验的结果选取药脂比、不同铜盐内相溶液(采用三乙胺调节pH值)、载药温度和载药时间4个因素,每个因素选3个水平,按L9(34)正交实验表进行正交实验,以脂质体的包封率(EE%)为评价指标,实验因素与水平见表1,正交实验结果见表2。由极差R可知,影响因素的主次顺序为:A>C>D>B,最佳条件为A2B2C2D3。按照优选条件,药脂比为1∶10,内相溶液为0.3mol·L-1pH7.5硫酸铜三乙胺溶液,孵育温度60℃,孵育时间30min,按照载药量1mg·mL-1,连续制备3批米托蒽醌脂质体。2.3脂质体外观表现将米托蒽醌脂质体用水稀释适当倍数后,采用冷冻蚀刻电镜法观察,可见脂质体外观圆整,粒径分布较均匀。用NanoS90绿光粒度测定仪测定样品的平均粒径为(99.5±1.9)nm,多分散系数PDI在0.02~0.05之间。脂质体粒径分布见图1,冷冻蚀刻电镜照片见图2。2.4脂质体中米托的检测采用葡聚糖凝胶SephadexG75色谱柱,洗脱液为0.9%氯化钠,室温下进行。精密移取米托蒽醌脂质体100μL上柱,氯化钠溶液洗脱,按照蓝色色带分段收集脂质体于10mL量瓶中,游离药于5mL量瓶中,分别用异丙醇定容。采用HPLC分别测定脂质体部分和游离部分米托蒽醌的含量。脂质体溶液中米托蒽醌总量的测定:精密移取米托蒽醌脂质体100μL,用异丙醇定容至10mL量瓶中,进行HPLC检测。液相色谱条件为:十八烷基键合硅胶色谱柱,以缓冲液(取庚烷磺酸钠6.6g,加冰醋酸9.0mL,用水溶解并稀释至1000mL)-乙腈(70∶30)为流动相;检测波长:244nm,柱温:30℃,流速:1mL·min-1。包封率(%)=脂质体所包封的米托蒽醌的量/(脂质体所包封的米托蒽醌的量+游离米托蒽醌的量)×100%。3批样品包封率测定结果的平均值为(95.0±0.6)%。2.5降低溶血透照率的方法HSPC是构成脂质体的关键辅料,其在生产贮存过程中会发生水解和氧化,从而导致膜的流动性降低,引起脂质体的聚集和沉淀,加速药物渗漏,产生毒性。已知HSPC为含有不同长度碳链的磷脂酰胆碱混合物,其中十六碳和十八碳的两条侧链比例为13∶86,因此产生的溶血卵磷脂以十八碳链卵磷脂为主。故本实验以单硬脂酰卵磷脂为对照品,采用薄层色谱法对脂质体中的溶血卵磷脂进行限度检测。精密称取适量单硬脂酰卵磷脂对照品,用甲醇溶解并定容,得到质量浓度为0.2mg·mL-1的溶血卵磷脂对照溶液。精密量取米托蒽醌脂质体0.5mL,分别加入1.5mL甲醇和0.5mL氯仿混匀,作为供试品溶液。精密量取供试品溶液和对照溶液各10μL分别在GF254硅胶板上点样,以甲醇-氯仿-氨水=50∶13∶1.4为展开剂进行展开,展开前沿到达大约7cm处时取出晾干,放入碘缸内熏蒸约10min后显色,比较两斑点的大小和深浅。3批米托蒽醌脂质体的溶血卵磷脂均小于1.0mg·mL-1,薄层照片见图3。2.6包封率、溶血胆固醇的变化将3批米托蒽醌脂质体在2~8℃条件下放置,于第0、3、6个月分别取样,考察粒径分布、包封率、溶血卵磷脂的变化情况。结果显示,脂质体外观性状良好,粒度、包封率、溶血卵磷脂没有明显变化,各项检测结果见表3。2.7药代动力学研究结果取接种7d的L1210腹水瘤BDF1小鼠,断颈处死,无菌条件下以RPMI1640培养基稀释腹水,调整瘤细胞数为2.5×106个·mL-1。将瘤细胞悬液腹腔接种于雄性BDF1小鼠,接种体积0.2mL。接种完成后,剩余瘤细胞悬液在光镜下计数,活瘤细胞数>95%。接种24h后,将动物按体重随机分为3组,每组10只,分别经尾静脉单次注射给予Mit-lipo6mg·kg-1、Mit-free6mg·kg-1及5%葡萄糖注射液。每天监测动物的体重和存活情况,60d后终止实验。实验结果以动物中位生存时间(MST)和生命延长率(ILS)来评价药物的治疗效果。ILS=[(给药组MST/对照组MST)-1]×100%。以动物体重的降低来评价药物的毒性。数据采用SPSS11.5统计软件Survival的Kaplan-Meier过程进行生存分析。结果显示,与空白组相比,Mit-lipo和Mit-free均显著延长了荷瘤鼠的生存时间(P<0.01),且Mitlipo较Mit-free的ILS略大。体重下降的比较中可见,Mit-free的动物体重下降较Mit-lipo大,这表明了游离药物的毒性要大于脂质体药物的毒性,见表4。2.8血药浓度与准确度KM小鼠72只,随机分为2组,每组36只,雌雄各半。第一组尾静脉注射Mit-free4mg·kg-1,给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4h取雌雄各3只小鼠进行眼眶静脉取血。第二组尾静脉注射Mit-lipo4mg·kg-1,给药后0.083、0.5、1、4、8、24h取雌雄各3只进行眼眶静脉取血。将鼠血置于肝素抗凝管中,以2500r·min-1离心10min,取上层血浆50μL,加入纯化水50μL,加入酸化异丙醇50μL,甲醇350μL,漩涡混合30s,-20℃放置1h,10000r·min-1离心10min,取上清液20μL进行HPLC测定。液相色谱条件为:十八烷基键合硅胶色谱柱;C18保护柱;检测波长:650nm;流动相:缓冲液(取庚烷磺酸钠6.6g,加冰醋酸9.0mL,用水溶解并稀释至1000mL)-乙腈(70∶30);柱温:30℃;流速1.0mL·min-1。采用DAS(ver2.1.1)药动学软件对血药浓度数据进行计算。血浆样品中内源性物质不干扰待测物的测定;米托蒽醌的血浆浓度在0.01~50μg·mL-1内线性关系良好,相关系数0.999;米托蒽醌低、中、高3个质量浓度(0.1、1.0、10.0μg·mL-1)的回收率为92.0%、98.2%和99.1%;日内精密度均小于8.5%,日间精密度均小于10.3%。药动学统计参数见表5,药动学曲线见图4。与Mit-free相比,Mitlipo具有更高的AUC和t1/2,更低的清除速率和更小的分布容积。3纳米托脂质体的载药特性米托蒽醌为水溶性药物,提高水溶性药物的包封率是脂质体制剂的一大难题。有报道显示,应用金属离子梯度法可以实现多柔比星的成功装载,其原因在于多柔比星能与金属离子形成复合物。由于米托蒽醌与多柔比星同属于蒽环类抗肿瘤药,并且可以和Cu2+形成稳定的复合物,由此推断米托蒽醌可以通过铜离子梯度法实现药物的装载。在本实验中,系统的研究了不同pH值、不同阴离子的铜盐为内相的米托蒽醌脂质体的制备,分析得出最优处方的载药机制如下。当弱碱性药物米托蒽醌与空白脂质体孵育时,在外相pH值环境下呈电中性的米托蒽醌跨膜扩散进入脂质体内水相,其中一部分米托蒽醌迅速质子化然后与SO42-形成稳定的沉淀;另一部分米托蒽醌则与Cu2+结合形成稳定的复合物。以上两种机制形成的膜内外药物浓差促使膜外的米托蒽醌继续跨膜扩散,进入膜内后被SO42-和Cu2+所捕获,最终使得大部分米托蒽醌包封于脂质体中。另外2种内相脂质体包封率低的原因分析如下。由于Cl-与米托蒽醌不能形成沉淀,因此以氯化铜做内相时只存在铜离子络合一个载药动力,所以包封率较硫酸铜内相脂质体略差。采用三乙胺调节pH值的硫酸铜较不调节pH的硫酸铜做内相包封率更高的原因可能是三乙胺在内相脱氢后溢出脂质双层膜,留在膜内的H+促进米托蒽醌质子化后与硫酸根沉淀,然后继续拉动