分子发光分析法

S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫2023/11/282.激发态→基态的能量传递途径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁

激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9

s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；2023/11/28非辐射能量传递过程

振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12

s。

内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。

外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。2023/11/282、荧发光谱基本特征

a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。

b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图

2,

1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如

‘2)。

c.

镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。2023/11/28镜像规则的解释

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁亦然。

2023/11/28200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱2023/11/288.1.3荧光的产率与分子结构的关系

1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（

）：荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；2023/11/282.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基团（-NH2、-OH），使荧光增强。有吸电子基团，使荧光减弱（-X、-NO2）。2023/11/282023/11/288.2.1仪器结构流程

测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。

特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。8.2分子荧光与磷光分析法2023/11/28仪

器

光

路

图2023/11/28可获得三维光谱图的仪器可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图2023/11/288.2.2荧光分析方法与应用1.特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？检测下限：0.1～0.1

g/cm-3相对灵敏度：0.05mol/L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少

缺点：应用范围小。2023/11/283.应用(1)无机化合物的分析

与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析（见表）2.定量依据与方法标准曲线法,比较法2023/11/282023/11/282023/11/288.3分子磷光分析法荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。

测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶。2023/11/288.3.2磷光分析法的应用1.稠环芳烃分析

采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表2.农药、生物碱、植物生长激素的分析烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析检测限0.01

g/cm-3

3.药物分析和临床分析见表2023/11/282023/11/282023/11/288.4.1化学发光分析的基本原理

在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。

A+B=C+D*D*→D+h

（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当

E=170～300kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。8.4化学发光分析法2023/11/28

O3

→O2+O（1000C石英管中进行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h

发射光谱范围：400～1400nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与CO的发光反应：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h

发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与NO的发光反应：2023/11/288.4.2化学发光分析测量装置与技术装置流程：发光反应室光检测器信号放大器显示与记录

发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：

静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；

流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；2023/11/282023/11/281、特点1.灵敏度极高

例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17。Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量2.仪器设备简单不需要光源、单色器和背景校正；3.发射光强度测量无干扰无背景光、散射光等干扰；4.线性范围宽5.分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。8.4.3化学发光分析法的特点及应用2023/11/28（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可检测低至10-9mol/L的