cd3、cd4、cd8对细胞增殖能力的影响

cd3、cd4、cd8对细胞增殖能力的影响

许多研究证明了这两种情况下男女的免疫反应不同。根据该报告，雄性激素受体存在于胸腺和骨髓的不成熟免疫细胞，但成熟的免疫细胞没有出现。此外，雌激素和雌激素受体也存在于胸腺细胞中，并能诱导胸腺的萎缩。这些结果提示类固醇激素很可能促成了免疫系统的雌、雄差异,然而确切的机制尚不清楚。本研究的目的是通过比较年幼的雌、雄小鼠的免疫应答,分析免疫应答的差异与性激素分泌前后的关系。我们用3～9周龄(含青春期前、中、后)的BALB/C小鼠,分离胸腺和外周淋巴细胞,经CFSE标记,流式细胞仪检测体外不同刺激剂后T细胞CD3、CD4、CD8表面标志的不同表达。结果表明免疫系统的性别二态现象可能位于青春期前。1材料和方法1.1杂交瘤细胞接种小鼠腹泻制备雌、雄性BALB/C小鼠,3～9周,购自中科院遗传所。抗TCRαβmAb(H57.597)为杂交瘤细胞接种小鼠腹腔制备的腹水。FITC标记的抗CD8mAb(536.7)、PE标记的抗CD4mAb(GK1.5)、PerCP标记的抗TCR方法mAb(H57.597)均购自PharMingen公司(晶美公司代理)。1.2方法1.2.1dmso-cfse法标记细胞5-Carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,简称CFSE(MolecularProbes,Eugenem,OR)溶于DMSO,浓度为5mmol/L,-20℃存放,作为母液。PBS调整细胞浓度为5×107ml-1,加入CFSE,终浓度为5μmol/L,37℃孵育10分钟,孵育结束后,迅速用冷10%NCS1640溶液洗涤细胞3次。1.2.2细胞引导因子10%NCS-1640溶液调整胸腺、外周淋巴细胞浓度为1×106ml-1,加入24孔板,分别加入anti-TCRαβmAb(50μg/ml包被,37℃,2小时)、刀豆蛋白A(ConA2.5μg/ml,Pharmacia)、佛波醇酯(PMA)和钙离子载体(ionomycin,IONO)(PMA浓度10ng/ml,IONO浓度300ng/ml)共刺激,细胞在含5%CO2孵箱培养3天。1.2.3facs细胞的检测1×106细胞加入1μg荧光抗体,4℃,40分钟,2%NCS-BSS洗去游离抗体。染色后的细胞加入FACS保存液,用CELLQuest软件在装配双激光管的流式细胞仪(FACSCalibur,BD公司)上进行分析。多重染色时,用同种性荧光染色的对照,调节流式细胞仪的电压。1.2.4统计分析实验结果经t检验分析。2小鼠的免疫特性2.1断颈处死3～9周年龄段的小鼠,称取体重后,用无菌方法取出胸腺和脾脏,称重。每年龄段小鼠3只,取三次独立试验的均值。结果不同年龄段雄性小鼠体重均超过雌性,4～5周时雄性小鼠的体重增加迅速,由4周时约(11.2±5.3)mg增至(18.4±6.2)mg,6～9周体重增加不明显(P>0.05),由约(20.5±10.1)mg增至(23.1±11.3)mg。雌性小鼠体重是逐渐增加的,每周大约增加(2.3±1.6)mg。比较相同时间段雌雄小鼠胸腺和脾脏大小,结果6周雄性小鼠胸腺(80±10)mg明显大于雌性小鼠(44±15)mg,6周后胸腺的重量减少,雄性小鼠比雌性明显(P<0.05)。器官与体重百分比却无明显差异。脾脏和胸腺的细胞数量与器官重量的改变相一致。2.2分离脾脏、胸腺淋巴细胞,CFSE标记后,细胞分别用抗TCR抗体、ConA、PMA+Ionomycin进行刺激,3天后,各种刺激剂作用下细胞表面CFSE的荧光强度呈现梯度衰变趋势,FACS分析比较不同刺激剂对不同年龄段T淋巴细胞的活化作用,结果PMA+Ionomycin作用最强。在PMA+Ionomycin刺激剂作用下,3～7周小鼠脾细胞存在明显的性别差异,7～8周小鼠脾细胞对抗TCR抗体诱导的增殖应答也存在性别差异:雌性小鼠增殖能力明显低于雄性小鼠(图1A)。胸腺细胞对PMA+Ionomycin的增殖应答无明显的性别差异。胸腺细胞对ConA,抗TCR抗体刺激剂的应答能力低于脾细胞(图1B)。2.3小鼠按性别、年龄分组:3～4周组,6～9周组,每年龄段小鼠3只,取三次独立试验的均值。分别用三染分析脾脏T淋巴细胞表面CD3、CD4、CD8的表达(图2A),结果6～9周小鼠CD3+细胞所占百分率明显高于3～4周小鼠,年长小鼠CD4、CD8的表达量也高于年幼小鼠。脾细胞CD3、CD4、CD8的表达量与性别无关。胸腺细胞CD3、CD4、CD8免疫表型分析显示(图2B),6～9周小鼠胸腺CD4、CD8单阳性细胞含量多于3～4周小鼠,而CD4+CD8+双阳性细胞含量少于3～4周小鼠。胸腺CD3表达无年龄改变。胸腺细胞CD3、CD4、CD8的百分率无性别差异。3抗tcr抗体、论哲学的作用本次研究我们观察到脾脏和胸腺大小与年龄有关,证实了以前的研究:胸腺随着年龄的增加而减小。本次结果显示6～8周龄雄性小鼠脾脏和胸腺重量的减少比雌性小鼠明显,并且雄性小鼠的胸腺变化更明显,这种变化与青春期开始后雄激素分泌有关。称取处死后3～7周龄雄性小鼠的睾丸,发现随着胸腺重量的减小,睾丸重量增加(数据没显示),支持了雄激素能诱导胸腺萎缩的观点。雌性小鼠胸腺重量的减少与雄性小鼠相比不明显,我们的数据也支持了雌激素诱导胸腺萎缩比雄激素慢的观点。雄激素和雌激素对胸腺产生不同的影响,但我们的实验显示:青春期前后胸腺的免疫表型和胸腺细胞的增殖并没有雌雄差异。3～4周小鼠不成熟的CD4+CD8+双阳性细胞虽多于6～9周小鼠,但对于丝裂原刺激的应答却没有不同。抗TCR抗体的作用类似抗原识别的生理过程,ConA也是通过细胞表面TCR进行信号转导,并使细胞凝聚,介导细胞—细胞间辅助分子与配体的结合,并能提供一些辅助刺激信号;因此经TCR进行信号转导的抗TCR抗体、ConA刺激剂,仅对成熟T细胞起活化识别作用,胸腺内成熟T细胞仅占10%,抗TCR抗体、ConA刺激剂的促增殖作用较小。PMA+ionomycin是一种强的丝裂原,可不经TCR的识别,直接激活PKC和胞内的钙离子库,而直接活化胞内双信号,无论不成熟的髓质细胞还是成熟的髓质区细胞均可对PMA+ionomycin产生应答。抗TCRαβ抗体刺激剂诱导7～8周小鼠脾细胞的增殖应答有性别差异,并且6～9周脾细胞CD3+细胞数量明显多于3～4周的幼鼠,但CD3+脾细胞的总数和成熟CD4、CD8T细胞的百分率无性别差异,为此,雄性小鼠细胞的高增殖应答可能反应了对经TCR进行信号转导的抗TCR抗体刺激剂的高敏