溶藻弧菌分离及其耐药性研究

溶藻弧菌分离及其耐药性研究

溶藻弧菌（va）属于嗜盐细菌和嗜盐菌，广泛分布于世界各地的海水和河流入海口。这是中国海洋的主要优势细菌。该菌是水生动物的主要致病菌,可通过受损的鱼类皮肤和口腔而引发感染,并可导致人类的多种疾病,包括皮肤表面伤口感染和溃疡、蜂窝组织炎、坏死性筋膜炎,耳部中耳炎和外耳炎,眼部结膜炎、骨髓炎、脑膜炎以及败血症等,近年来的研究证实,该菌与副溶血弧菌一样,是沿海地区腹泻病和食物中的常见病原菌。抗生素在渔业的大量使用会使病原菌对药物的敏感性下降甚至消失,增加了病害的防治难度,并且对抗生素的耐药的食源性细菌可以通过食物链传递给人类,同时也可能将耐药基因转移给其他致病菌和环境菌株。国内外关于溶藻弧菌耐药性的研究主要的研究对象是食物中毒菌株和临床分离菌株,而对于环境中溶藻弧菌的耐药性研究相对较少。本实验在食物中毒高发的夏季,在上海临港海域近海水中分离出33株溶藻弧菌,并对分离菌株进行了20种常见抗生素的药敏实验,旨在了解上海临港海域的溶藻弧菌分布及其耐药性情况,并为人类临床和兽医用药及进行食源性疾病控制提供参考依据。1材料和方法1.1材料和试剂溶藻弧菌标准菌株ATCC17749上海复祥生物公司;大肠杆菌标准菌株ATCC25922获赠于上海出入境检验检疫局;样品100份样品均在2012年6~9月采集于上海临港地区,使用无菌采样器采集水下10~20cm深处海水,并于3h内送回实验室进行处理;细菌学蛋白胨、硫柠胆蔗琼脂培养基(TCBS)及胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)上海市浦东新区疾病预防控制中心;科玛嘉弧菌显色培养基(CV)上海科玛嘉微生物技术有限公司;PCR反应试剂盒及所用引物等生工生物(上海)有限公司;MH(MuellerHintonAgar)琼脂培养基及20种抗生素药敏试纸片杭州天和微生物试剂有限公司。ClassIIBSC生物安全柜新加坡ESCO公司;PTC-200PCR仪及GelDocXR凝胶成像系统美国Bio-Rad公司。1.2实验方法1.2.1溶藻弧菌的分离培养所有样品均使用含30g/LNaCl的碱性蛋白胨水,37℃,120r/min振荡培养18~24h,用接种环挑取培养液于TCBS平板划线,于37℃培养18~24h。挑取TCBS上的圆润黏稠的黄色单菌落纯化2~3次后,接种于CV培养基平板,于37℃培养18~24h,观察菌落特征,溶藻弧菌在CV培养基上的典型菌落为透明或半透明、光滑湿润的白色菌落。挑取疑似菌株进行革兰氏染色、10%NaCl嗜盐性生长实验和邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)实验进行初筛,实验方法参照文献,并以溶藻弧菌标准菌株ATCC17749作对照。1.2.2rt-pcr扩增溶藻弧菌及扩增条件初筛后的菌株接种于含3%NaCl的TSB液体培养基中于37℃,120r/min振荡培养(12±2)h。采用水煮法提取DNA:取纯培养物1mL于10000r/min离心5min,弃上清,用500μL无菌生理盐水悬浮菌体,置于干式恒温仪100℃保持10min,0℃保持10min,10000r/min离心3min,取上清液储存在-20℃备用。HSP60是溶藻弧菌的特征基因,在GenBank中登录号为AY332570,若分离菌株经PCR可扩增出560bp的条带,则判定为溶藻弧菌。其上下游引物序列分别为:P1:5’ACAACAGCAACGGTACTAGC3’和P2:5’CAACTTTCACGATGCCAC3’,反应体系20μL:2×PCRMaster10μL、ddH2O7μL、DNA模板1μL、上下游引物各1μL。PCR反应的扩增条件:94℃预变性6min;94℃变性30s,55℃退火35s,72℃延伸1min,30个循环;72℃再延伸10min,4℃冷却。PCR扩增产物用100V电压,1%琼脂糖凝胶电泳40min。1.2.3抗菌活性的测定采用美国临床和实验室标准协会CLSI推荐的纸片扩散法(Kirby-Bauer)测定分离菌株对20种抗生素的敏感性。分别挑取在TCBS上培养18~24h的各菌株单菌落于含3%NaCl的TSB培养基中37℃、120r/min振荡培养6~8h,用无菌生理盐水调节菌液浓度为0.5麦氏浓度(OD625=0.08~0.13)。取200μL菌液至直径为90mm的无菌平皿中,定量加入灭菌后冷却至46℃左右的MH琼脂培养基25mL(含1%NaCl),充分混匀,静置20~30min后贴药敏试纸片。每种抗生素贴2个药敏试纸片,每个平板贴5片。(35±1)℃培养16~18h后用游标卡尺测量抑菌圈,实验结果判读参照文献,以大肠杆菌ATCC25922为参考菌株进行质控。20种抗生素的含量及耐药折点见表1。2结果与分析2.1菌落的选择100份海水样品增菌液中有42份在TCBS平板获得黄色菌落,将其纯化并转接到CV培养基中,得到透明或半透明、边缘光滑、表面湿润的白色菌落33份。将33株疑似菌株进行革兰氏染色、10%NaCl嗜盐性生长和ONPG实验三种生化指标的鉴定,结果均为革兰氏阴性短杆菌,能够在含10%NaCl的碱性蛋白胨中生长和ONPG阴性,与标准菌株ATCC17749的实验结果一致。2.2溶藻弧菌特异性基因检测提取33株疑似菌株的DNA进行PCR反应,电泳图谱显示所有菌株均在560bp出现条带,即扩增出溶藻弧菌特异性基因HSP60。部分溶藻弧菌的PCR扩增结果见图1。2.3溶藻弧菌对20种抗菌药的耐药性33株溶藻弧菌对抗生素均存在不同的耐药性(见表2),其中DH030对羧苄青霉素、氨苄青霉素、头孢噻吩、头孢哌酮、氨苄青霉素/舒巴坦、庆大霉素、丁胺卡那霉素、四环素、万古霉素、多粘菌素B和痢特灵共11种抗生素具有耐药性,其耐药率高达55.0%;DH024对羧苄青霉素、万古霉素和利福平具有耐药性,DH031对羧苄青霉素、氨苄青霉素和万古霉素具有耐药性,耐药率均为15.0%。其他菌株对20种抗生素的耐药率在20.0%~50.0%之间。比较33株溶藻弧菌对20种抗生素的耐药性(见图2),可以得到如下结论:溶藻弧菌对氨苄青霉素、羧苄青霉素和万古霉素有很高的耐药性;对头孢吡肟、安曲南、环丙沙星、诺氟沙星、红霉素及氯霉素均100.0%敏感;溶藻弧菌对头孢1到4代的耐药率虽不是持续降低,但对其药物敏感性不断增高;溶藻弧菌对同类抗生素的耐药性也有很大不同,如氨基糖苷类的庆大霉素和丁胺卡那霉素,耐药率分别为15.2%和72.7%;溶藻弧菌对某些抗生素虽然耐药率不高,但也不敏感,处于中介敏感范围,如头孢噻吩、头孢呋辛和复方新诺明。本次分离的溶藻弧菌均至少对3种及3种以上抗生素多重耐药(见表3),同时对6种及6种以上抗生素耐药的有15株,占总数的45.5%,同时对8种及8种以上抗生素耐药的有6株,占总数的18.2%。3k-b扩散法药敏实验溶藻弧菌会分解TCBS平板中的蔗糖,使其菌落呈黄色,但培养时间超过24h后,部分菌落会变成绿色,这是由于培养基中的蔗糖被消耗完全所造成的,因此在使用TCBS培养基对溶藻弧菌进行分离时,应选择在37℃生长24h内的典型菌落。同样能够在TCBS平板上形成黄色菌落的弧菌还包括霍乱弧菌、鳗弧菌等,但通过CV培养基上的菌落形态、10%嗜盐性实验和ONPG实验基本可以排除。因此,在对溶藻弧菌进行分离鉴定时,可先用TCBS和CV平板进行选择性分离,再用革兰氏染色、10%嗜盐性实验和ONPG实验这三种重要的生理生化指标进行初步筛选,最后采用分子生物学方法验证,可在保证分离的准确性的同时减少鉴定的工作量。K-B扩散法是一种经典的药敏实验方法,到目前为止,CLSI的推荐方法仍然为用无菌棉拭子蘸取0.5麦氏浓度的菌液,挤压棉拭子上的多余菌液后在MH平板上进行涂布。但细菌的接种量仍然受到棉拭子大小和操作人员对棉拭子的挤压程度的影响。在使用培养基、药敏试纸片的质量和药物含量、培养时间相同的条件下,细菌的接种量越大,抑菌圈越小。为消除接种量对药敏实验结果的影响,本研究在经过质控菌株大肠杆菌ATCC25922对抗生素的药敏实验后,确认了本次采用200μL的0.5麦氏浓度菌悬液定量接种后倾注培养基的方法能使抑菌圈具有窄的分布范围和更好的重复性。本研究从100份海水样品中共分离得到33株溶藻弧菌,检出率为33.0%,并且所有分离菌株均表现出多重耐药性(多重耐药率为15.0%~55.0%),提示我们在食用海产品或海产品加工过程中需采取有效的灭菌措施,防止食源性致病菌引起的食物中毒、阻止耐药菌株在肠道中将耐药基因转移给致病性更强的细菌。在20种抗生素中,溶藻弧菌分离菌株对羧苄青霉素、氨苄青霉素和万古霉素的耐药性较高,对头孢吡肟、安曲南、环丙沙星、诺氟沙星、红霉素及氯霉素均表现敏感。但不同地点和时间分离的溶藻弧菌耐药谱具有很大差异[19,20,21,22,23,24,25],因此有必要对各地的溶藻弧菌耐药谱进行实时监控,从而选择合适的药物来进行对其引起疾病的防控。近年来我国的食品安全问题愈发突出,食源性致病菌的耐药性对食品安全及人类身体健康的影响已经引起了广泛的关注。细菌耐药性的产生一方面是因为抗生素的广泛使用提供了细菌的耐药突变形成了选择性压力,使耐