耐盐酵母在酱油发酵食品中的应用

耐盐酵母在酱油发酵食品中的应用

耐盐母是一种具有长期应用前景的极端环境微生物。它在高盐环境中是一种非常应用的极端微生物。在蔬菜、黄瓜、风味转变中，对产品的口感和质量有显著改善。其作为简单的单细胞真核微生物不但具有特殊的生理结构和代谢机制,而且能产生许多有着特殊性质的生物活性物质,使其能够抵抗外界环境的胁迫。因此,近年来其受到了学者们的广泛关注。本文介绍了耐盐酵母在酱油等发酵食品中的应用,并结合前人的研究成果阐述了酵母的耐盐机理,旨在加强人们对耐盐酵母的了解,促进其在实际生产中的应用以及相关学科的研究。1耐盐酵母的发酵酱油是以大豆和小麦为原料,利用微生物分泌的各种酶将植物蛋白质及碳水化合物水解、发酵形成的具有独特色、香、味、体的液体调味品。其香气成分极为复杂,现在已知有300多种,主要是醇类、醛类、酚类、酯类、呋喃类、吡嗪类等。其相互平衡制约、衬托助长,构成酱油特有的酱香和酯香。酱油独特风味是在酿造过程中由微生物引起的一系列生化反应形成的,其中原料发酵成熟的快慢、成品颜色的浓淡以及味道的鲜美主要与米曲霉和酱油曲霉相关,而酱油香味则与酵母菌和乳酸菌有着直接相关的关系。酵母在酱油发酵过程中,可以利用酱醪中的还原糖进行酒精发酵,发酵己糖生成醇,赋予酱油醇和酒的香气,其中乙醇除参与风味的形成外,还具有一定的抑菌作用,对于酱油的保存非常有利。日本把乙醇含量作为衡量酱油质量的一个重要指标,要求出口的A级酱油中乙醇含量须大于800mg/100mL。酵母分解亮氨酸和异亮氨酸生成的戊醇和异戊醇与酱油中的有机酸形成酯,可以改善酱油的酯香味,另外在酵母发酵后期,酵母细胞自溶,胞内富含的蛋白质、核酸、碳水化合物等大分子物质,变成易于人体吸收的小分子物质,赋予酱油风味和营养。传统生产中,酱油发酵过程中的酵母主要来自环境中落入的酵母,其数量和种类不确定,不利于酱油工业的现代化生产。另外酱醪发酵中食盐的含量很高,尤其在高盐稀态发酵后期,由于水分蒸发等因素使得酱醪的含盐量高于18%,严重抑制了酵母菌生长活力。所以,向酱醪中添加耐盐产香酵母已成为目前人们提高酱油风味的主要手段。TRAMPERJ等在日本高盐稀态酱油酿造过程中添加耐盐酵母菌,结果证实了耐盐酵母对酱油风味的影响。谢韩等将含有耐盐酵母的生酱油接入低盐固态原油中再发酵一个月后,检测发现,酱油中还原糖含量下降30%,乙醇含量上升到0.40g/100mL~0.70g/100mL,酱油明显变得酯香浓郁,鲜甜适口,口味绵长。李琴等在低盐固态发酵工艺生产的二油、三油中添加鲁氏酵母AS2.180和球拟酵母AS2.202进行再发酵和采用先固后稀添加鲁氏酵母和球拟酵母浇淋后酵增香用于改善酱油风味,结果采用新工艺生产的酱油无论在感官指标还是理化指标都比国内天然酱油要好。CATRINUSVANDERSLUIS等研究表明,酵母菌通过代谢赋予酱油最具有代表性主体香气物质包括4-乙基愈创木酚、4-羟基-2-乙基-5-甲基-3-呋喃酮、4-乙基苯酚、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮,并被STEINHAUSP等通过采用分子感官科学的方法予以证实。王林祥等对添加了耐盐酵母的高盐稀态酱油中的对酸性和中性挥发性组分进行了GC/MS分析,共鉴定出59种化合物,发现与传统的发酵工艺相比,添加了耐盐酵母的产品具有独特的酱香气味,且其主要成分为杂环化合物,如呋喃类、吡嗪类、吡咯类及一些含硫化合物。目前,用于改善酱油风味物质的耐盐产香酵母主要有S酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、T酵母菌(Torulopsisversatilis)和C酵母菌(Candidaversatilis)3大类。1.1s酵母laa-somS酵母是最常见的高渗透压酵母菌,在含盐量为5%~8%的培养基中生长状态良好,在含盐量18%的培养基中仍具有生长能力。其是许多传统发酵食品(如酱油、日本味噌(miso)和泰国发酵鱼制品(plaa-som))的生产菌种,目前尚无证据表明S酵母对人类有致病能力。S酵母是酱油酿造中后期风味物质形成的重要菌株之一,能够提供酱油的风味物质包括乙醇、高级醇、异戊醇(3-甲基-1-丁醇)、异丁醇(2-甲基-1-丙醇)等芳香杂醇类物质和4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮、4-羟基-2-乙基-5-甲基-3-呋喃酮(HEMFs)、2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮(DMHF)等呋喃酮类化合物。其中,DMHF是具有草莓、芒果、菠萝等水果风味的重要的芳香化合物。HEMFs是一种具有类似小甜饼干的焦糖风味的成分,其能代表酱油的主体香气,在酱油中含量越多越好。1.2t酵母添加量T酵母也是影响酱油风味成分的重要菌株。在酱油发酵中添加T酵母不仅可以增加乙醇产量,也可以产生4-乙基愈创木酚(4-EG)和4-乙基苯酚(4-EP)——赋予酱油一种丁香香味和烟熏味,增加了酱油的圆润感,且在发酵前期添加对酱油风味的改善效果明显。人们通常将T酵母与S酵母共同培养,让其协同发酵,达到改善酱油风味的目的。但T酵母添加量过大,会影响乳酸菌、S酵母和T酵母的代谢平衡,从而影响酱醪的pH值、香气和滋味。所以T酵母添加时应控制其添加量和添加时期。本实验曾在高盐稀态酱醪发酵的前期(15d)和后期(45d)分别添加S酵母、T酵母和C酵母,通过气相色谱法对发酵结束后的酱醪进行香气种类和含量分析得出,在不同时期分别添加3种耐盐酵母的高盐稀态酱醪都比未添加酵母的酱醪所产生的风味成分要多,尤其在15d添加T酵母明显高于其他,由此得出T酵母的最佳添加时间是酱醪发酵的前期(第15d)。1.3由微生物酵母所的细反应制备的鲁氏酵母C酵母在酱油发酵中可以产生酚类化合物(如4-EG和4-EP)。酱油原料——小麦在处理过程中可被分解成阿魏酸(ferulaicacid)和香豆酸(对羟苯丙烯酸,coumaricacid),然后被多变假丝酵母转化成4-EG和4-EP,而这个反应不是鲁氏酵母所能完成的。另外,C酵母在高盐条件下还能使麦芽糖发酵生成乙醇。2化准确的出口耐盐酵母在长期的进化过程中已经形成了精准和完善的适应机制,使其能够根据周围环境的变化准确的做出应答。WATANABEY等总结Z.rouxii耐盐机制主要有:一是产生胞内渗透压调节物(如甘油、海藻糖、游离氨基酸及其衍生物、尿素和甲胺、甜菜碱和肌氨酸等);二是通过Na+-ATP酶和Na+/H+-反向转运蛋白调节胞内阳离子的动态平衡。2.1为控制渗透性物质和母细胞耐盐性能2.1.1hog-mapk级联系统调节的单次给药途径研究发现了以下几个随着分子生物学的发展,人们对酵母菌耐盐性有了深入的认识。酵母对高盐环境的适应机制主要表现为细胞在胁迫条件下一系列信号转导和基因表达过程,特别是转录水平上的激活和阻遏。目前的研究表明,酵母的基因组中大约有200多个基因与酵母的耐盐性有关。人们已发现酵母在高盐环境中起作用的信号传导途径有高渗透性甘油促分裂原激酶(high-osmolarityglycerolmitogen-activitedproteinkinase,HOG-MAPK)途径、依赖于Ca+/CaM的钙调磷酸酶(CaN)途径、环腺-磷蛋白激酶A(cAMP-dependentProteinKinaseA,Ras-cAMPPKA)途径和雷帕酶素靶分子(targetofrapamycin,TOR)信号途径。其中,研究比较清楚的当属HOG-MAPK途径。当酵母菌处于高盐环境中时,细胞外的渗透压大于胞内渗透压,为了阻止胞内水分外排,细胞会作出应答,在胞内迅速积累甘油来提高胞内渗透压。而甘油的积累正是由MAPK级联系统介导的HOG途径来完成的。MAPK级联系统是细胞适应外界环境变化的一种非常重要的调控机制。MAPK级联系统由3种蛋白激酶组成:MAPK,MAPKK(MAPKkinase)和MAPKKK(MAPKKkinase)。研究发现,HOG途径上游的渗透压信号感受体主要通过2条支路进行协调控制:一是由Sho1和Ste11跨膜蛋白组成;另一条信号输入支路相对复杂,由Sln1,Ypd1和Ssk13组分蛋白组成的跨膜负荷物构成。这2个途径采用不同的方式进行控制,相对相互独立,但又不是绝对分开。当高盐渗透信号被Sln1和Sho1支路接受后,Sln1将信号通过Ypd1和Ssk1传到Ssk2或Ssk22(Ssk2的同工蛋白),Sho1则将信号传给Cdc42,Cdc42继而通过Ste20激活Ste11。Ssk2(或Ssk22)和Ste11这2种不同的MAPKKK可以依次将其下游的蛋白激酶MAPKK-Pbs2和HOG-MAPK级联的核心分子MAPK-Hog1中的Thr174和Tyr176残基磷酸化和激活,最终导致Hog1从细胞质向细胞核转移。进入细胞核的Hog1通过激活Hot1、Msn2/Msn4、Sko1和/或Smp1等转录因子对产生甘油所需要基因的进行表达,从而开始甘油的积累。表达甘油所需的基因包括GDP1、HSP12和DDR1等,其中GDP1是HOG途径中典型的甘油表达基因,能够使细胞过量合成并积累甘油,在短时间内提高胞内渗透压,抵抗高盐环境对细胞带来的危害。但甘油长时间积累对细胞生长也是不利的,酵母细胞中HOG途径的负调控是通过蛋白磷酸酯酶Ptp2、Ptc1、Ptc2和Ptc3对磷酸化的Hog1进行去磷酸化来完成。HOG-MAPK途径:除了通过控制甘油合成与终止外,甘油通道蛋白(FPS1)在酵母细胞渗透压调节方面也起着重要的作用。在高盐胁迫条件下,酵母细胞会在数秒内收缩,在1min内迅速关闭Fps1,防止甘油外排,与此同时,HOG途径在很短时间内被激活;当胞内甘油合成过量时,Fps1又会打开,把过量甘油输送至胞外。酵母细胞正是在这种精细准确的调控机制之下,才能迅速适应外界环境变化,维持自己的新陈代谢。2.1.2海藻糖的合成海藻糖是酵母细胞内除甘油外的另一种渗透保护剂。CGHOUNSA等报道,由于海藻糖在稳定期的积累,使得稳定期的酿酒酵母在极度渗透压环境下的存活率要明显高于对数期的细胞;不能合成海藻糖的突变株(tps1Δ和tps2Δ)比同源性的野生菌株对高渗环境更敏感。同样,分别以葡萄糖和乙醇为碳源的指数期的酵母细胞在极度渗透压的环境中,前者细胞死亡率要比后者高3~4倍,与此相对应的是前者细胞内无海藻糖检出而后者可以检出。在高盐环境下,酵母细胞内与海藻糖代谢相关的基因表达量增加,导致海藻糖大量合成,而在正常状态下又会被迅速分解。在酿酒酵母和大肠杆菌等细胞中海藻糖的合成过程:酿酒酵母的海藻糖合成酶是由TPSI(TSSI)、TPSII(TSSII)和TSLI基因编的多酶复合物。TPSI基因具有初级调控功能,若该基因被阻断,则导致6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶失活。BELLW等还证实了在海藻糖合成酶复合体中TPSI基因、TPSII基因可以编码热休克蛋白(hsp),该蛋白可被热休克诱导合成。2.2高盐培养基中的atpase酶STEINKRAUS等报导鲁氏酵母的细胞含有一种哇巴因敏感的ATPase,这种酶被认为是一种Na+/K+激活的依赖于Mg2+的ATPase,并且适应于高盐环境的细胞与原始细胞相比,含有这种酶的比例较高。WATANBEY等发现Z.rouxii和S.cervisee中的ATPase的酶学性质仅有微小差别,并且生长于高盐培养基中的Z.rouxii细胞的ATPase酶活性比生长在无盐培养基细胞内要高。IWAKI等对ZrSOD2克隆和基因缺失的研究表明,该转运蛋白依赖质膜上ATP酶产生的跨膜H+梯度,将细胞质内的Na+外排,实现Z.rouxi在高盐环境中的生长。2.3膜外排反应盐胁迫时,酵母细胞除受甘油和海藻糖等相溶性物质调节外,细胞壁及细胞膜等组分、含量和结构也对盐胁迫作出了应答:细胞膜麦角固醇种类和含量、脂类的组成发生变化,阻止甘油外排;细胞壁中几丁质和甘露聚糖含量下降;胞壁上具有活性功能的某些蛋白质阻止盐进入细胞,且胞壁蛋白含量与培养基中氯化钠浓度成正比增加。3耐盐酵母的使用3.1目前在酱油酿造过程中使用的耐盐酵母的增香机制尚不十分明确,仍需要采用现代生物化学与分子生物学技术手段,结合仪器分析等现代技术进一步研究。3.2耐盐酵母在酱油生产中应用效果受多方面影响,如酵母最适生