分子生物学 常用分子生物学技术的原理及应用

哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室刘兴汉分子生物学

MOLECULARBIOLOGY常用分子生物学技术的原理及应用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridizationandBlottingTechnique一、分子杂交与印迹技术的原理

DNA变性：

双链DNA在各种理化因素作用下变为单链的过程。本质是碱基对之间的氢键断裂。DNA复性：

去除变性条件，变性DNA重新形成双链的过程。常用变性条件：

加热分子杂交：

不同来源的单链核苷酸链根据碱基互补原则形成杂种双链的过程。分子杂交的目的：

检测DNA和RNA

探针：

分子杂交中和待测核苷酸链碱基互补的被标记的核苷酸链。碱基对间氢键探针待测DNA或RNA增色效应：

DNA变性伴随260nm吸收值增高减色效应：

DNA复性伴随260nm吸收值降低原因：

硷基中共轭双键的暴露Tm值:分子杂交的方法:（固—液杂交）

1.斑点杂交：

提取DNA或RNA，直接点在硝酸纤维素膜上，和探针杂交

检查有没有你所要的DNA或RNA硝酸纤维素膜待测DNA或RNA

杂交液探针1234SlotblotDotblot反向斑点杂交

固相：多种探针序列

液相：一种待测样品(标记）

DNA点阵：

将多种探针序列成排的点在硝酸纤维素膜上，检测DNA或RNA和那一个探针杂交。待检样品进行标记一种样品多种探针多种探针序列标记待测核酸基因芯片：

将更多的探针排列在硅片上，借助计算机检测未知的DNA或RNA和那一个探针杂交2.原位杂交

组织固定技术与分子杂交技术结合

组织切片或细胞涂片原位杂交：

将DNA或RNA在组织切片和细胞涂片中变性和固定，和探针杂交确定DNA或RNA在组织和细胞中的定位。

菌落或噬菌斑原位杂交：

基因工程中筛选阳性克隆。

3.转移印迹技术电泳技术与分子杂交技术结合电泳结果从凝胶转移到固相膜上，称之为blotting膜上样品再与探针杂交样品中哪一个是目标ＤＮＡ或ＲＮＡ转移印迹实验①②③放射自显影照片—＋滤纸凝胶硝酸纤维膜印迹技术的类别及应用

WesternBlotting常被用来检测基因表达12341.正常细胞2.正常细胞/凋亡素3.肿瘤细胞4.肿瘤细胞/凋亡素细胞核内的热休克蛋白70

1234第二节核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis核酸序列分析的基本原理：化学裂解法

(Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法

(Sanger法)FrederickSanger蛋白质测序技术获１９５８年诺贝尔化学奖ＤＮＡ测序技术获１９８０年诺贝尔化学奖一、DNA链末端合成终止法运用ＤＮＡ复制的原理底物中加入双脱氧核糖核苷酸合成引物用同位素标记链末端合成终止法测定DNA序列的原理负极5′3′合成链模板链ddG

ddA

ddT

ddCCGGCTAGCTAATCGCGGCTATA5′3′正极二、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同颜色荧光分子标记四种双脱氧核苷酸合成时分4管分别合成，电泳时4管产物混合一起电泳后，通过四种激光激发荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。第三节聚合酶链反应PolymeraseChainReactionKaryBanksMullis1983年27岁发明PCR技术

1993年获诺贝尔奖5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA一、PCR技术的工作原理5

5

5

5

5

5

5

5

Cycle35

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR体系基本组成成分

PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚CPCR是体外DNA复制过程，最原始的目的是扩增DNA.RNA可以经逆转录为DNA,再用PCR扩增（二）目的基因的克隆cDNA文库或基因组文库中克隆基因真核基因在原核表达时用RT-PCR扩增mRNA二、PCR技术的主要用途（一）微量DNA和RNA的扩增利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。

（三）基因突变TGC将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。（四）DNA序列测定（五）基因突变分析逆转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆转录PCR技术三、几种重要的PCR衍生技术逆转录法方案：AAnATTnT5′5′mRNA逆转录酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1双链cDNA3′5′

3′5′

5′加热变性加入特异性引物DNA聚合酶重复上述步骤扩增出大量的产物PCR用于检测在mRNA水平上的基因表达差异要防止扩增效率不同产生的误差要管家基因作内对照原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。（二）原位PCR技术固定组织或细胞蛋白酶K消化处理PCR扩增原位杂交显微镜观察结果基本方法（三）实时PCR技术实时PCR(real-timePCR)又称荧光定量PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过外标准对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AddMasterMixandSampleDenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AnnealingReactionTubeTaql5’3’RQProbe5’3’RQ定量PCR示意图5’3’5’3’5’3’RQExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’4.Detection5’3’3’QTaqR5’lR定量PCR示意图反向PCR逆转录PCR原位PCR重组PCR不对称PCR多重PCRPCR衍生技术锚定PCR巢式PCR免疫PCR连接酶链式反应实时PCR递减PCR

第四节基因文库GeneLibrary基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)

基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。一、基因组DNA文库基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有

噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。

二、cDNA文库基因组文库和cDNA文库的构建和筛选第五节生物芯片技术BiologicalChipTechnique一、生物芯片的概念

指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固相介质表面构建的微型分析系统，以实现对组织细胞中DNA、蛋白质及其他生物组分的快速、高效、敏感地处理与分析。生物芯片（biochip）信息芯片：

将与生命相关的信息分子高度集成，来实现对基因、蛋白等生物活性物质进行高通量的检测与分析基因芯片（DNA芯片）蛋白质芯片组织芯片细胞芯片功能芯片（微流体芯片）

在芯片上完成生命科学研究中样品的分离、扩增、生化反应等功能

生物样品制备芯片核酸扩增芯片毛细管电泳芯片将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上与待测的荧光标记样品进行杂交用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。

一、基因芯片基因芯片(genechip)基因芯片工作流程示意图生物战剂检测

临床疾病的基因诊断法医学鉴定药物研究开发动植物检疫

基因组研究后基因组计划生物信息学基因芯片基因芯片技术的应用领域将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质芯片(proteinchip)蛋白质芯片作用原理第六节生物大分子相互作用研究技术

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）常用蛋白质相互作用的研究技术标签融合蛋白结合实验是基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合分析两种分子结合的具体结构部位筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。

标签融合蛋白沉淀实验流程示意图(二）酵母双杂交技术的基本原理和用途

酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转录激活因子结构与功能的认识真核生物转录激活因子DNA结合结构域转录激活结构域BDAD组件式：结构可互相分开功能互相独立空间较近时表现活性中间序列对活性无影响报告基因

在GAL4结合的顺式作用元件下游需连接报告基因。

目前应用最多的报告基因是LacZ基因，表达后能在X-Gal培养基上产生蓝色菌落。

其次是His基因，表达后能使酵母菌在缺少组氨酸的培养基中生长。

现在多提倡两种报告基因同时应用，颜色筛选和营养缺陷筛选同时进行，以降低假阳性的出现

表达电泳迁移率变动测定(EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gelshiftassay)用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未标记探针10X凝胶迁移实验结果示意图染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图遗传修饰动物模型的建立及应用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel

第七节转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。

转基因——被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)——目的基因的受体动物一、转基因技术核转移技术

即动物整体克隆技术，将动物的一个体细胞核全部导入另一个体的去胞核的的激活的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone)。二、核转移技术基因剔除技术(geneknockout)

也称基因靶向(genetargeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术

基因剔除操作过程与机制1.构建基因打靶载体2.将重组载体转入小鼠胚胎干细胞

将重组载体转入小鼠胚胎干细胞中靶的ES细胞移入胚泡，胚泡植入子宫，筛选嵌合体小鼠

建立动物模型①单基因决定疾病模型基因剔除获得性突变(gain-of-functionmutation)②多基因决定疾病模型四、基因转移和基因剔除在医学发展中的作用第八节疾病相关基因的克隆与鉴定CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候选基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候选基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)定义

通过对一种致病基因功能的了解来克隆该致病基因。（一）功能克隆应用

生化机制已明确、基因表达产物较易得到纯化的遗传性疾病。利用蛋白质的表达及功能信息抗原抗体反应提纯蛋白质制备抗体建立cDNA文库阳性克隆提取重组体筛选测序氨基酸序列信息：氨基酸序列设计寡核苷酸探针（简并密码）cDNA文库阳性克隆序列分析筛选提取重组体利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。用不同人的DNA片段转化与人类遗传疾病具有类似表型的突变酵母可以恢复(rescue)正常表型的片段中所含有的基因即可能为致病基因这种实验称为功能互补试验(functionalcomplementationassay)。表型与人类疾病相似的酵母突变株表型恢复正常人类正常基因（二）定位克隆定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作①

遗传学分析(确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析②分子生物学分析将病人的DNA和正常人的DNA进行杂交，去除相同部分，剩余部分既是致病基因利用基因在染色体位置的信息杜氏肌营养不良致病基因的定位克隆：

遗传学家族连锁分析将致病基因定位于Xp21

病人Ｘ染色体和正常人X染色体杂交，去除能杂交的ＤＮＡ片段正常染色体上不能杂交的片段既是致病基因（三）非定位候选基因克隆策略

由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。根据致病基因的可能功能，检测因特网基因库中的基因功能区将含有接近功能域的基因用于致病的改变检测。（四）定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。基因诊断和基因治疗第九节GeneDiagnosisandGeneTherapy基因变异致病类型内源基因的变异基因结构突变基因表达异常外源基因的入侵

特点针对性强特异性强灵敏度高

适应性强基因诊断的概念和特点定义利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。基因诊断常用技术方法（二）聚合酶链反应(PCR)（三）基因测序（四）基因芯片（五）连锁分析（一）核酸分子杂交技术疾病相关遗传标志的连锁分析连锁：同一条染色体上位置相邻的基因被一起遗传而没有发生重组。连锁分析：利用与致病基因相连的某些基因作为遗传标志，通过鉴定遗传标志的存在判断个体是否带有致病基因。连锁分析无需了解致病基因的结构和分子机制，适用于由未知基因缺陷引起的遗传性疾病间接诊断：没有直接检测致病基因无重组发生重组用于连锁分析的遗传标志

1.不同个体之间存在高度的多态性多态性：在一个特定的基因座位上存在两个以上的等位基因，其中的任何一个等位基因在群体中的频率大于1%。2.需要获得足够的家系成员样本。3.致病基因和标志基因连锁，两个基因的距离越近越好。限制性片段长度多态性

限制性内切酶识别特定DNA序列并在此序列内切断DNA

单个硷基突变可丢失或获得限制性内切酶的切点切割片段长度不同，电泳分开限制性片段长度多态性与致病的基因连锁分析GAATTCCTTAAGGAATTTCTTAAARLFP分析法×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析PCR/单链构象多态性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。

正常人纯合突变杂合突变Leber

病患者PCR/SSCP分析+﹣短串联重复序列（STR）

人类基因组25%为重复序列卫星DN