高脂高糖喂养联合sz制备2型糖尿病大鼠模型的研究

高脂高糖喂养联合sz制备2型糖尿病大鼠模型的研究

糖尿病是一种严重的慢性疾病之一，严重危害人类健康。近年来,随着老龄人口的增加、人民生活水平的提高以及饮食结构的改变,糖尿病的发病率呈逐年上升趋势,成为继心血管、肿瘤疾病以后的第3号健康杀手。目前,全球约有1.5亿人患有糖尿病,其中90%以上是2型糖尿病,其发病机理尚未完全阐明。因此,建立合适的2型糖尿病动物模型,对研究其病因、发病机理、完善预防及临床治疗具有重要意义。国内外研究一致表明,制备2型糖尿病大鼠模型可通过高脂饮食诱导大鼠胰岛素抵抗后,再注射低剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)损伤胰岛功能,引起血糖升高,可模拟2型糖尿病的发病过程。本研究以SD大鼠作为实验动物,观察不同剂量的STZ对模型建立的影响,以选取最佳剂量来诱导产生糖尿病大鼠模型,为糖尿病及其并发症的研究提供理想的动物实验技术平台。1材料和方法1.1动物驱动模型SPF级雄性SpragueDawley(SD)大鼠60只,6周龄,体质量180~200g,购于武汉大学动物实验中心,动物合格证号:42000600002150,使用证号:0012272。室内通风良好,室温20~25℃,相对湿度40%~70%,每日光照12h,自由摄食饮水。1.2饲料水食源量高脂高糖饲料按照以往文献报道的配方做部分调整,成分如下:20.0%猪油、15.0%蔗糖、2.5%胆固醇、0.4%胆酸钠及62.0%常规饲料。1.3欺凌科技公司STZ(美国Sigma公司),大鼠胰岛素放射免疫方法试剂盒(碧云天生物技术公司),大鼠总胆固醇试剂盒和甘油三酯试剂盒(武汉凌飞科技公司)。柠檬酸(批号:20120521)及柠檬酸钠(批号:20120509)购自武汉洁美试剂公司。稳豪OneTouch血糖测量仪及试纸(美国强生公司)。STZ溶液的配制方法:将STZ溶解于0.1mol/L(pH4.4)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,新鲜配制成1%STZ溶液。STZ必须保存于-20℃冰箱,现配现用,配好的柠檬酸缓冲溶液和STZ溶液应避光冰浴,30min内用完。1.4饲料或饲料饲养高脂高糖喂养4周,将大鼠按随机数字表法随机分为3组:(1)对照组,20只,腹腔注射柠檬酸50mg/kg,普通饲料喂养。(2)糖尿病造模组,根据腹腔注射STZ剂量的不同,分为了2个组,各20只,分别腹腔注射STZ50mg/kg或35mg/kg(模型1组及模型2组),注射后3d取尾静脉血检测大鼠血糖,以空腹血糖值≥16.7mmol/L,并稳定10d,则为大鼠糖尿病造模成功。1.5观察指标和方法1.5.1观察小鼠的一般情况和生存每天观察大鼠进食量、饮水量、排尿量及死亡情况,每隔1~2周称重。1.5.2elisa检测elisa及血糖敏感指数糖尿病大鼠模型建好后,大鼠禁食不禁水12h后剪尾取血检测大鼠空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG)及空腹血清胰岛素(fastingseruminsulin,FSI)水平,采用大鼠ELISA试剂盒检测,并计算胰岛素敏感指数(insulinsensetivityindex,ISI)。同时采用日立8060全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平。1.6统计学分析方法采用SPSS17.0软件进行统计学分析,实验数据以均数±标准差(ue0af±s)表示,计量资料各组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。2结果2.1糖尿病临床表现实验期间,对照组大鼠体质量无明显变化,精神状况良好,双目有神,反应敏捷,毛发有光泽,无糖尿病临床表现(成模率为0),也无死亡。两模型组大鼠体质量逐渐增加,注射STZ后则出现生长迟缓、身体消瘦、精神萎靡、倦怠懒动、嗜睡、反应迟钝、臀尾出汗潮湿、臀毛枯黄、拉尾排便,伴有多食、多饮、多尿等典型的糖尿病临床表现;其中模型1组的糖尿病成模率为75%(15/20),死亡率为25%(5/20),其中4只大鼠在注射STZ24h后死亡,经解剖发现,其肾脏和脾脏有瘀血,脏器变小,推测可能是由于大剂量的STZ损伤了肾脏和脾脏,最后导致大鼠的死亡;另1只大鼠在注射STZ3d后死亡,系高血糖形成酮症酸中毒所致。而模型2组的糖尿病成模率为85%(17/20),死亡率为0,分别高于或低于模型1组(P<0.05)。2.2fbg及fsi水平结果见表1。由表1可见,两模型组大鼠的FBG及FSI水平均明显高于对照组(P<0.05),ISI则低于对照组(P<0.05);模型1组的FBG水平高于模型2组(P<0.05),同时FSI水平低于模型2组(P<0.05)。提示模型组大鼠均出现了明显的高血糖和高胰岛素血症为特征的胰岛素抵抗。2.3两组大鼠混凝土和tc水平比较与对照组比较,两模型组大鼠的血TG和TC水平均明显升高(P<0.05),而两模型组间比较差异无统计学意义(P>0.05),见表2。3成功建立sd大鼠2型糖尿病模型的可行性目前,构建糖尿病大鼠模型的方法主要有自发性糖尿病动物模型、转基因/基因敲除糖尿病动物模型和STZ与饮食协同作用所致糖尿病动物模型。但前两者由于存在来源相对减少、饲养和繁殖条件要求严格、动物价格昂贵等缺点,限制了其在科学研究中的广泛应用和普及。目前,国内外最常用的是STZ与饮食协同作用所致糖尿病动物模型。本研究采用高脂高糖饲料喂养结合小剂量STZ注射的方法成功建立了2型糖尿病大鼠模型,为糖尿病及其并发症的发病机理、预防、诊断及治疗的研究提供理想的动物实验技术平台。高脂高糖饮食是诱发2型糖尿病及胰岛素抵抗的重要因素。高脂高糖饮食导致体内糖脂代谢紊乱,通过糖脂肪酸循环、胰岛素信号传导等多个途径抑制糖储存,降低胰岛素敏感性,进而导致胰岛素抵抗的发生。STZ对胰岛β细胞具有高度选择性毒性作用,通过自由基损伤胰岛β细胞,使其发生功能障碍,胰岛素合成减少,引发糖尿病。高脂高糖饲料喂养结合小剂量STZ注射方法建立的动物模型更接近人类2型糖尿病的特点。在本研究中,模型1组大鼠经高脂高糖喂养4周后,50mg/kgSTZ腹腔注射,成模率为75%,但是死亡率亦高,达25%;其中4只死亡大鼠经解剖发现,其肾脏和脾脏有瘀血,脏器变小,推测可能是由于大剂量的STZ损伤了肾脏和脾脏,最后导致大鼠的死亡;另1只大鼠在成模后死亡,系高血糖形成酮症酸中毒所致。研究表明,单纯的高脂高糖饲料喂养可以使动物血糖升高,但需要很长时间,至少要6个月到1年以上。如果一次性大剂量注射STZ,则直接损伤胰岛β细胞,则更倾向于1型糖尿病的表型特点,影响研究结果,而且死亡率明显增高。因此不建议一次性大剂量注射STZ。本研究中的模型2组大鼠经高脂高糖喂养4周后,予以35mg/kgSTZ腹腔注射,成模率增高,达85%,模型稳定,无大鼠死亡,是理想的2型糖尿病模型;其中有3只大鼠未成模,其原因系注射部位选择不当,导致药物误入皮下,从而降低了成模率。高脂饮食诱导时间延长,动物肥胖和胰岛素抵抗更加明显,加重了胰岛素分泌功能的负担,故所需STZ剂量减少。小剂量(30mg/kg)注射STZ可激活机体免疫系统,诱导胰岛的免疫反应,产生更接近于2型糖尿病的模型。Zhou等发现,高脂高糖喂养4周后腹腔注射STZ40mg/kg,成模率为72.2%;张玉领等发现,高脂高糖喂养4周后,待大鼠出现明显的肥胖和胰岛素抵抗时,一次性腹腔注射STZ30mg/kg,可成功制备2型糖尿病大鼠模型;施红等发现,高脂高糖喂养6周后加一次性腹腔注射STZ30mg/kg,可成功制备空腹和随机血糖均升高、糖耐量减低及高血脂的2型糖尿病大鼠模型。本研究考虑到动物的年龄以及造模后续的实验还需要一定的时间,因此选择了高脂高糖饲养时间为4周,予以35mg/kgSTZ腹腔注射成功建立了2型糖尿病大鼠模型。综上所述,高脂高糖喂养4周后,一次性腹腔注射STZ30~40mg/kg,均可成功制备2型糖尿病大鼠模型。对于成功建立SD大鼠2型糖尿病模型,笔者有以下几点体会:(1)STZ必须保存于-20℃冰箱中,现配现用,配好的柠檬酸缓冲溶液和STZ溶液应避光冰浴,30min内用完;0.1mol/L、pH4.2~4.5的柠檬酸缓冲液可作为STZ理想的溶剂。(2)注射STZ前,对大鼠禁食不禁水12h以上,可提高成模率;注射STZ后,应观察2h左右,给予充足的饮水和食物;STZ注射在腹腔的固定一侧,可保证相同实验条件,成模后血糖数据均一稳定。(3)腹腔注射时抓住大鼠头朝下,腹腔朝上,使内脏移向上腹,避免注射入其他脏器内;另外,还要注意注射部位的适当选择,避免药物误入皮下、降低成模率。(4)STZ诱导糖尿病大鼠模型有性别差异。Morimoto等发现,雄性大鼠制备模型的成模率明显高于雌性大鼠。另外,选择成年雄性,可避免因受孕而影响观测数据。蒋升等发现,雄性大鼠腹腔注射STZ后14d血糖稳定,而雌鼠4周后血糖才稳定,而且成年后的雌激素对糖脂代谢会产生一定的影响。因此选择雄鼠造模对后续实验干扰更少。(5)大鼠对于STZ的敏感性有年龄依赖性,成鼠或大体质量鼠较幼鼠或小体质量鼠的成模率高。因此,本研究选择了成年雄性大鼠,体质量均大于180g。(6)在动物饲养期