ax亚型汉族家系abo基因序列变异分析

ax亚型汉族家系abo基因序列变异分析

abo血型是最重要的血样系统，从abo血型系统的三个主要等位基因（a1、b、o）编码到abo进行分类后，它首先被分解为雅马拉乔等人的克隆序列。根据aa和b等位基因，蓝色信号的物质由5553个氨基酸组成。这是由短氮端、疏水侧和左右c重环境区组成的糖基转移酶。近来不同人种、不同个体ABO变异的等位基因被报道。在以往的研究中,我们观察了随机中国汉族人群ABO血型的基因,探讨了中国汉族人群ABO普通血型基因的遗传背景。在目前的工作中,我们进一步研究了中国汉族人群变异的ABO亚型。通过测序而使我们可以推测某个氨基酸对于催化区域糖基转移酶活性特异性或水平的影响。在这个研究中,我们发现一个Ax血型家系的数个个体中ABO基因第七外显子有新的点突变导致表达蛋白中氨基酸改变。对象和方法1.对象一个ABO血型为Ax的家系,先证者(家系样本编号为3)为我单位的健康捐血者,采集的血样本共计5份,样本编号示图1。2.反定型红细胞及人源抗ab/a血型正反定型、吸收放散试验、唾液物质测定均按文献方法,其中抗A、抗B血清(Ortho公司),抗A1、抗H血清(Dominion公司),反定型红细胞及人源抗AB血清为自制。3.热启动技术使用G&T公司ABO基因分型试剂盒,能够检测A101、A102、B1、O1、O2、A2016种等位基因,内对照为扩增人类生长激素(HCH)基因的扩增产物为207bp。采用热启动技术即95℃预温5min,然后95℃30s,60℃30s,72℃90s进行30个循环,72℃延伸5min进行扩增。PCR产物检测:4.0%琼脂糖,10V/cm电泳25min。紫外灯下确定结果。4.pcr扩增按文献OlssonML设计的引物,mo-46:5′cggaattcactcgccactgcctgggtctc3′,mo-57:5′cgggatccatgtgggtggcaccctgcca3′;用于扩增第6外显子252bp的片断;mo-71:5′gggcctaggcttcagttactc3′,mol-101:5′cgggatccccgtccgcctgccttgcag3′(由上海生工所合成)用于扩增第7外显子843bp的片断。PCR反应体系包括:每种dNTP400μmol/L,Mg2+2.5μmol/L,10×PCRbuffer5μl,Taq酶3U,模板DNA500ng,每条引物0.1μmol/L,终反应体系50μl。PCR反应在PE9600扩增仪上进行,循环参数为:95℃10min;94℃60s,63℃90s,72℃60s,10个循环;94℃60s,61℃90s,72℃60s,25个循环;72℃10min。扩增产物经TakaraDNAFragmentPurificationKit(大连宝生物公司)纯化,配成25～30μl的DNA测序模板。使用循环测序试剂盒(TheBigDyeTerminatorCycleSequencingKit,美国ABI公司)直接测序,测序引物与本研究扩增ABO基因第6、7外显子的引物序列相一致,正、反方向通测,用ABI3100DNA测序仪检测、SeqPOP6BDv1软件分析结果。5.特异性序列的测定对上述4中第7外显子的扩增产物,使用表1中所列的2个引物进行特异性序列的测定。测序反应的产物经纯化,用ABI3100测序仪检测,SeqPOP6BDv1软件分析结果。由于2条测序引物分别是正反向的,测得序列的5′与3′端会产生重叠。电泳结果及序列分析被检家系5份血型及唾液型物质结果见表2。标本编号为1、5的样本定为O1O1,标本编号为2样本定为A102A102,标本编号为3的样本定为A102O1,样本编号为4的样本定为B1O1O1,4种电泳结果示于图2。以正常A101、B101、O1等位基因序列对照,发现样本编号为2、3共计2份样本出现467C/T、829G/A、1009A/G杂合。出现的467C>T、829G>A、1009A>G突变不能确定在哪条单倍体上,对此2份样本第7外显子的扩增产物进行ASP序列分析,发现467T、829A、1009G突变发生在同一条单倍体基因上,这个新Ax等位基因829位、1009位序列图谱见图3,4。ax-7基因的突变Ax亚型是ABO血型一种较为常见的弱表现型,其血清学特点是红细胞上A抗原位点数目稀少,而H抗原活性相应增强,与大多数B型人血清中抗A不发生凝集,而与大多数O型人抗AB发生凝集,血清中常含有抗A1,偶尔含有凝集A1也凝集A2的抗体,Ax分泌型唾液中会有正常H抗原,但A抗原极少,常常不能测出。本家系经唾液中型物质分析与血清学检测,可以确定出现的弱A表现型为Ax。国外已报道的Ax亚型等位基因有8种,见表3。在日本,3份被检Ax表型的个体,2份为646T>A,为ABO*Ax-1,另外1个与A102序列一致。Ax-1与A101相比,只有646位核苷酸T转变为A,导致了216位氨基酸由P变为I,糖基转移酶的活性大大降低。Ax-4与Ax-1相比,多了一个无义突变681G>A。Ax-7与A101相比,在996位核苷酸G转变为A,导致了332位变为终止密码。Ax-8与A101参比序列相比,是在第6内含子中发现众多突变,内含子的变异会影响mRNA的剪接。其余5种Ax等位基因,都是染色体上DNA重组导致杂合基因,而使得翻译的糖基转移酶活性也大大降低。5份Ax等位基因都含有646T>A,681G>A,771C>T,829G>A这4种变异,而这4种突变点均能在O1v中找到。Ax-2是含297A>G这个典型的B等位基因突变,文献上把它定为B-O1v;Ax-3交换位置是在外显子6的nt298与内含子6nt41之间,文献上把它定为A1-O1v;Ax-5交换位置在内含子6中。Ax-6交换位置也在内含子6中,但位置与Ax-5不同,文献上均把Ax-5、Ax-6定为A1-O1v杂合。我们在这个家系中发现两例(1例Ax亚型,1例A型),标本A基因含467C>T、829G>A、1009A>G突变。这3个突变将导致156位氨基酸由脯氨酸(Pro)变为亮氨酸(Leu),277位氨基酸由缬氨酸(Val)转变为甲硫氨酸(Met),337位氨基酸由精氨酸(Arg)转变为甘氨酸(Gly)。在A基因中,已有文献报道过467C>T、1009A>G这两个点突变,含这两个突变的A基因被定为A205基因,我们以往的研究也表明在中国人群中A2亚型的分子结构以A205占优势。但在A205基因的基础上多了个829G>A突变,这在所有人种中未见报道,这个Ax新变异等位基因已获Genbank的注册号(DQ092380)。这个新基因在该家系中呈稳定遗传,先证者母亲(样本编号2)表现为A型,但经基因分析,且其女为Ax型,可以知道其基因型为A102/Axnew。由于A205型基因中也有464C>T与1009A>G两个突变,Ax新基因与A205基因相比,其控制的血型糖基转移酶表达出来的A抗原血清学活性与A2糖基转移酶相比有着极大的降低,所以可知,829位G>A突变是导致A型糖基转移酶活性大大降低的主要原因。推测在Ax等位基因mRNA翻译成转移酶后,由于277位氨基酸由缬氨酸转变为甲硫氨酸后,蛋白构象