富硒猴头菇对小鼠肠道菌群的影响

富硒猴头菇对小鼠肠道菌群的影响

猴头是属于担子菌亚门、异距鸡子菌亚门、无距鸡子菌亚门、无褶皱菌、猴头菌科、虎头菌科。猴头及其提取物广泛用于胃肠道疾病特别是对胃肠道炎症和溃疡以及消化道癌症辅助的治疗。有人对猴头菌制备物(猴头菌子实体制备液、猴头菌深层培养物以及猴头菌多糖)的抑菌活性进行实验,证明猴头菌各制备物对细菌、酵母菌和霉菌均有不同程度的抑制作用。体外实验和动物实验证明,有机硒有着很强抗菌活性,有显著减少小鼠肠道中的大肠埃希菌数量的效果。许多补益类中草药对双歧杆菌、嗜乳酸杆菌有明显的促进生长作用,包括枸杞子、地黄、五味子、黄芪和白术等。本文将考察富硒猴头冻干粉对小鼠肠道菌群的影响,判断其是否具有调节肠道菌群的效果。1材料和方法1.1头菇冻干粉的制备猴头菇冻干粉,由猴头菇鲜品冷冻干燥制得。富硒猴头菇冻干粉是在猴头菇培养基中加入亚硒酸钠培养,冷冻干燥制得,样品中有机硒含量156μg/g。昆明小鼠,雄性,清洁级,体重18～22g。1.2给药剂量及给药时间50只小鼠随机分为5组,分别为蒸馏水对照组,普通猴头菇冻干粉组和富硒猴头菇冻干粉高、中和低3个剂量组,每组10只。高、中和低剂量组分别给予富硒猴头菇冻干粉3、0.3和0.03g/(d·kg·BW)。普通猴头菇冻干粉对照组给予0.3g/(d·kg·BW)普通猴头菇冻干粉,空白对照给予等量蒸馏水。灌胃给药,灌胃容量0.3ml/10g体重。每天1次,持续3周。除灌胃外,小鼠给予正常饲料和饮水。1.3新鲜粪便的采集分别在灌胃前,灌胃后第21天,停止灌胃后3d无菌采集新鲜粪便样。轻压小鼠直肠部位在无菌环境下收集新鲜粪便,装于事先灭菌的EP管中,每组实验小鼠收集5个标本。立即将EP管封口,记录重量,-20℃冷冻保存。1.4u3000结论DNA的提取:根据杨美芬等的方法,粪便样本加9倍体积的PBS(0.05mol/L,pH7.4)充分混匀,低速离心(1500r/min)5min,取上清,重复上述过程3次。合并上清,高速离心(10000r/min)3min取沉淀,沉淀用PBS洗3次,水洗1次,加入50μl水和50μl1%TritonX-100,100℃煮沸5min立即投入冰水中备用。DNA的纯化:将提取步骤所得液体高速离心(14000r/min)1min取上清,加入等体积酚、氯仿,振荡10s,高速离心10min取上清,加入2～2.5倍4℃95%乙醇,液氮冷冻20min后高速离心1min,取沉淀,乙醇重复沉淀1次,挥干乙醇,加入50μlTE,-20℃保存。1.5保菌剂的制备取大肠埃希菌和乳酸菌培养好的菌液(菌种来源:实验室保藏),用血球计数板确定浓度(大肠埃希菌浓度为4.4×107CFU/ml,乳酸菌浓度为1.86×107CFU/ml),取1ml菌液,10000r/min离心3min,PBS清洗,破碎,纯化步骤同1.4。双歧杆菌用PCR产物,测定A值。参照分子克隆,计算出拷贝数。1.6pcr反应taq酶活性。引物特异性:取各DNA标准品与一个粪便样品DNA进行常规PCR反应,反应体系为25μl:10×Buffer2.5μl,0.25mol/L4×dNTP0.5μl,25mmol/LMgCl22.5ml,2μmol/L上下游引物各0.5μl,5U/μlTaq酶0.15μl,DNA模板3μl,水15.35μl。反应程序为:95℃5min后,95℃15s,55℃1min,72℃45s,共35个循环,最后72℃10min延伸结束。用2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。1.7荧光定量pcrre作cy标准曲线的制作,将1.5所得DNA做10倍系列稀释,进行SYBRGreenⅠ作为荧光染料的实时定量PCR反应。反应体系25μl:SYBRPremixExTaqTM12.5μl,ROXReferenceDye0.5μl,上下游引物各0.5μl,模板2μl,水9μl。采用ABIPRISM7500FastReal-TimePCRSystem进行扩增。反应程序为:95℃预变性5min,95℃15s,60℃1min,80℃10s,读取荧光数据,共40个循环;反应完成后进行溶解曲线分析,从60℃到95℃缓慢升温,检测荧光数据。根据读取的荧光数据,由系统软件自动分析Ct值并生成标准曲线。样品的16SrDNA定量分析,将各粪便DNA样本分别进行3种细菌的16SrDNA荧光定量PCR反应。反应体系与标准曲线相同。每次实验同时做标准曲线。每个样品同时做3个复孔。样品根据标准曲线得到各样品中3种细菌的数量。1.8组患者xss的比较样品数据导入SPSS18.0统计软件进行分析,结果以x¯±sx¯±s表示,应用单因素方差分析比较组间差异。以P≤0.05为差异有统计学意义,以P≤0.01为差异有显著统计学意义。2结果2.1小鼠肠道pcr扩增产物的特异性分析用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析,可见,各标准菌株PCR产物均显示出特异性条带,与预期的DNA片段长度相吻合。粪便样本PCR扩增产物除目标条带外,并无明显非特异性扩增条带。可见各引物特异性较好,适合用于实时定量PCR反应(见图1)。2.2扩增产物的溶解曲线以不同拷贝数的标准品的对数为横坐标,Ct值为纵坐标得到各细菌的标准曲线,各菌的标准曲线见图2所示。每次反应完成后进行溶解曲线分析,可见溶解曲线均为单峰,说明扩增产物单一(图3)。扩增产物的TM值分别为:大肠埃希菌属81.24;乳酸杆菌属84.82;双歧杆菌属88.55。与预期产物TM值相符,说明所得扩增曲线为目标产物扩增曲线。2.3高剂量富硒猴头菇冻干粉对小鼠粪便中双歧杆菌的影响实验期间小鼠粪便中肠杆菌属的变化见表3所示,实验期间小鼠粪便中肠杆菌属与对照组相比无明显变化(P>0.05)。经口给予富硒猴头菇冻干粉21d后,小鼠肠道中的大肠埃希菌生长繁殖未受明显抑制。对小鼠肠道双歧杆菌数量的影响见表4所示。灌胃富硒猴头菇冻干粉后,实验组小鼠粪便双歧杆菌数量有所增加,与对照组相比达到显著水平(P<0.05),但高剂量灌胃富硒猴头菇冻干粉后,小鼠粪便中的双歧杆菌数量与对照组相比差异没有统计学意义,可能是由于双歧杆菌对于肠道环境中的硒浓度较为敏感,实验高剂量组的小鼠肠道中的硒浓度过高,对双歧杆菌的生长繁殖表现出一定程度的抑制作用。实验期间小鼠粪便中乳酸菌的变化见表5所示,对照组小鼠粪便中肠杆菌属无明显变化,实验期间菌数差异无统计学意义(P>0.05);实验组小鼠经口给予富硒猴头菇冻干粉以后,高剂量组小鼠肠道中乳酸菌的数量增加,达到显著水平(P<0.05)。实验结束后第3天,实验组小鼠乳酸菌数量与对照相比仍然较多。说明富硒猴头菇冻干粉对乳酸菌的生长繁殖有一定的促进作用。2.4富碘鸡干粉对实验大鼠体重的影响实验中各实验组小鼠与正常对照组相比,体重均无显著差异。实验结束解剖小鼠,未见异常。3肠道微生态调节剂动物实验结果显示,经口给予富硒猴头菇冻干粉21d后,小鼠肠道中有益菌乳酸菌的增殖得到促进,差异有统计学意义(P<0.05),证明了富硒猴头菇冻干粉对小鼠肠道菌有一定的调节作用。实验结束3d后,小鼠肠道中乳酸菌数量与对照相比仍然较多,但双歧杆菌数量恢复正常。与普通猴头对照相比,富硒猴头菇对乳酸菌的调节效果在3d后仍然保持(P<0.05),在调节肠道菌群方面有一定的优势。在本实验的给药浓度范围内,未见对肠道中大肠埃希菌生长繁殖的抑制。富硒猴头菇可能是通过其中含有的单糖,多糖等成分对小鼠肠道中的有益菌产生影响,而调节效果的持续的原因可能是有机硒成分作用与免疫系统而改善肠道环境。富硒猴头菇对肠道菌群影响的实际作用机制有待进一步实验研究。猴头菌促进两种益生菌生长的原因可能为:猴头中的糖分经肠道酶类分解成低聚糖类,如海藻糖,β-葡聚糖等,能促进双歧杆菌的生长。猴头菇中的硫胺素、核黄素等也是重要的益生菌促生长物质。猴头多糖经微生物发酵产生VFA(挥发性脂肪酸),VFA是肠道中抑制病原微生物的重要因素。高浓度的VFA可明显抑制沙门菌等的生长。同时发酵产生的酸性物质也可降低肠道pH,从而抑制某些pH敏感菌的生长,促进益生菌增值。硒作为GPx活性中心,肠道环境中硒含量的增加,将使菌体内GPx活性增强,起到清除自由基、解过多的过氧化氢、保护细胞膜的作用。另外,有研究表明GPx的类似物Se-2F3-ScFv能够阻止LDH(乳酸脱氢酶)的释放并保持其在正常水平内恒定。而LDH作为乳酸菌代谢的重要酶类,能够催化乳酸菌产生乳酸。以降低肠道环境中的pH,抑制有害菌生长。市面上最常见的肠道菌群调节剂为益生菌活菌制剂,易受抗生素影响,而富硒猴头菌通过不同于活菌制剂的途径调节肠道菌群结构,抗生素对其影响较小。且硒是谷胱甘肽氧化酶(GSH-PX)的组成部分,在代谢中传递电子,具有抗氧化、增强免疫、抗肿瘤的作用。富硒猴头菇含有丰富的硒,能够提高机体抗氧化能力,起到抗炎作用。对于接受抗生素治疗的胃肠道炎症患者,富硒猴头菇不失为一种优秀的肠道微生态调节剂。实验证明富硒猴头调节乳酸菌数量的作用在实验结束3天后仍然持续。硒提高宿主非特异性免疫功能,提高抵抗抗病原菌的能力。并且能够增强B淋巴细胞增殖功能,增强体液免疫。可能通过免疫系统影响致病菌在肠道上皮细胞的粘附,使肠道内形成一个较为稳定的环境为乳酸菌的稳定造了条件。并且,硒进入到乳酸菌菌体内,参与多种酶的作用,尤其的作为GPx氧化应激系统中酶的活性中心,起着抗氧化保护细胞的作用。硒的掺入保护了乳酸菌体氧化还原物质的稳定,起到保护菌体的作用。从而使乳酸菌数量稳定,使调节效果得到持续。猴头菌具有调节肠道菌群的作用,而有富硒猴头中的有机硒成分使其调节效果具有一定持续性。