乳酸菌外源蛋白表达系统研究进展

乳酸菌外源蛋白表达系统研究进展

蘑菇是一种能够大量发酵和产生水杨酸的革兰阳性细菌，包括胸骨细菌、乳酸菌和双壳菌。乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌,因其在食品工业各个领域中的长期应用已证明不具有致病性,被公认为安全级(GRAS,generallyrecognizedassafe)微生物。20世纪90年代,国内外学者开始致力于对乳酸菌分子生物学及作用机制的研究,以乳酸球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌作为基因工程受体菌,应用基因工程技术有目的、有选择地研制新一代微生态制剂,以更好的控制其参与食品加工、医疗保健的过程。通过分子生物学技术的不断进步为人们探索其新的应用潜力提供了基础,如利用基因工程乳酸菌在生物反应器内发酵食品或直接在人和动物消化道内生产蛋白等,其中最有前景的应用其作为活载体将治疗性蛋白或抗原传递至黏膜表面,继而同时诱导黏膜免疫和系统免疫。1乳酸菌1.1乳酸球形总外源蛋白表达系统乳酸球菌是乳酸菌中的典型菌种,其全部基因组序列已经获得。由这种GRAS细菌生产的外源蛋白可以直接应用,从而促进外源蛋白与环境之间的相互作用。乳酸球菌作为基因工程受体菌理想菌株有其独特的优势:首先,乳酸球菌是食品级微生物,有别于沙门菌、大肠埃希菌和痘病毒等活疫苗载体,而且乳酸球菌无强抗原性;其次,乳酸球菌本身分泌蛋白较少,Usp45是迄今已知乳酸球菌分泌的唯一可检测蛋白,减少了载体微生物的自身蛋白对外源分泌蛋白的干扰;第三,乳酸球菌不产生任何细胞外蛋白酶,不会引起分泌蛋白发生细胞外的降解。但是,乳酸球菌基本不在胃肠道内定植,此缺点使其因不能长期持续分泌外源蛋白而影响免疫效果。随着对乳酸球菌外源蛋白表达系统研究的逐渐深入,采用组成型和诱导型启动子实现了外源蛋白在乳酸球菌的大量表达,并开发出含有不同诱导型启动子的多种表达系统,如乳糖诱导转录系统、T7启动子的表达系统、噬菌体的表达系统,通过诱导物、抑制物或环境因子使外源基因的表达控制在需要的范围内。但是,表达的外源蛋白最终会导致不可控制的细胞溶解,因此仍不能成为理想的外源蛋白表达系统。1996年,deRUYTER等研发出一种基于乳酸球菌nisA启动子(由nisR和nisK组成)的可调控表达系统(NICE-System,nisincontrolexpressionsystem)。Nisin是一种生物安全肽,在一些国家作为食品保鲜剂使用于食品工业中,Nisin调控表达系统可以根据需要严格控制外源蛋白的表达量,并且其诱导效率可达1000倍以上。近年来由乳球菌表达的外源蛋白大多用此系统进行表达的。与此同时,也相继开发出一些根据环境条件如pH值,温度或离子浓度等的调节乳球菌启动子的外源蛋白表达系统。1.2外源蛋白的活性随着分子生物学技术的不断进步和各种乳酸球菌外源蛋白表达载体的成功开发,利用乳酸球菌表达外源蛋白已相对容易,但作为疫苗递呈活载体,乳酸球菌以何种方式向黏膜免疫系统提呈抗原,如何使所表达的外源蛋白与免疫系统之间有效的接触继而诱导免疫反应是一个巨大挑战。外源蛋白在乳酸球菌中多数以分泌形式表达,因此提高外源蛋白的分泌效率对于促进黏膜免疫反应是必要的。LeLOIR和RAWN等相继开发出多种适合于乳酸球菌的信号肽系列,为探索其他外源蛋白的在乳酸菌中的大量表达奠定了基础。实验证明,来源于乳酸球菌的USP45信号肽,为目前已知提高外源蛋白分泌效率能力最高的信号肽。研究者认为,在宿主细胞表面有效的表达外源抗原是活载体疫苗向黏膜免疫系统提呈抗原的最佳方式。因此对细胞表面表达系统的深入研究具有重大意义。RAHA等将Acma蛋白中一段255bp的具有膜结合特性的区域与肠病毒EV71的VP1蛋白A1和A3区域在乳酸球菌中进行融合表达,稳定性实验结果表明外源蛋白在宿主细胞膜上的结合能力大为增强。此研究为外源蛋白在宿主细胞膜上的准确稳定表达提供了基础。在乳酸球菌中表达外源抗原的工具和条件已经相对成熟,为进一步开发食品级的新型活黏膜疫苗提供了基础。NORTON等研究发现,给鼠口服免疫表达破伤风毒素片段C(TTFC)的重组乳酸球菌后,IgG和IgA水平显著提高,证实了乳酸球菌可有效提高黏膜免疫系统提呈抗原及诱导特异性免疫反应的能力。已有多种病原微生物抗原在乳酸球菌中得到有效表达[11,12,13,14,15,16,17,18,19,20](见表1)。2乳酸杆菌2.1乳酸杆菌的保鲜乳酸杆菌作为主要的益生菌被广泛应用于食品及饲料加工业,在功能食品、医疗保健、微生态制剂等领域的应用具有诱人的前景。目前,乳酸杆菌制剂已被应用于肠道的微生态治疗,口服乳酸杆菌能增强机体对抗原的细胞免疫和体液免疫反应。乳酸杆菌作为基因工程受体菌,其优越性主要表现在:(1)乳酸杆菌能在呼吸系统、消化系统、泌尿系统定植,对维持微生态平衡具有重要作用;(2)身为食品级细菌,易构建成食品级的基因克隆及表达系统,可以有效提高基因工程产品的安全性,并可在一定程度上简化表达产物的后期处理工艺;(3)同肠胃外免疫途径相比,通过黏膜免疫,可以诱发IgA产生;(4)具有免疫佐剂作用、固有免疫原性及对胆汁酸的抵抗力。因此,乳酸杆菌作为基因工程受体菌的应用前景十分广阔。2.2乳酸杆菌质粒乳酸杆菌的许多种类中均发现有质粒的存在,最早在1976年由CHASSY及其同事发现。分离得到质粒的菌株来源于植物、肉类、青储饲料、发酵剂及消化道。用DNA杂交和核苷酸序列分析证实,各种质粒之间具有不同程度的同源性,从而说明质粒间的横向传递和重组是相当频繁的。虽然质粒普遍存在乳酸杆菌中,但对其的功能了解甚少,这一点不同于乳酸球菌。乳酸杆菌的大多数质粒,尤其是小质粒均属隐蔽型的,但有些质粒编码功能已经明确,并被应用于乳酸杆菌的鉴定、定型、载体构建及修饰。乳酸杆菌质粒具有如下特点:(1)大多数为隐蔽型质粒;(2)乳酸杆菌质粒具有遗传稳定性;(3)乳酸杆菌中小型质粒拷贝数高;(4)部分乳酸杆菌质粒复制子宿主范围广泛,可在其他种类的革兰阳性菌及大肠埃希菌中发挥作用;(5)乳酸菌属的某些菌株的质粒也可作为乳酸杆菌的质粒,如由宿主范围广的乳酸球菌质粒pGK12构建出的乳酸杆菌基因转化系统;(6)某些乳酸杆菌质粒没有宿主特异性,如pLP501、pLPE323适用于广泛宿主范围,可在不同种类乳酸杆菌中增殖。表2列出了从乳酸杆菌中分离的质粒及构建的质粒。随着基因工程技术的发展,已分离出了乳酸杆菌的各种表达调控元件,对乳酸杆菌基因转录和翻译调控及蛋白质分泌机制有了进一步的了解,并通过对部分质粒DNA序列的测定,然后同已知序列质粒的基因进行比较来推测未知质粒基因功能的途径,相继开发出了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体、整合载体。研究发现乳酸杆菌质粒基因中普遍存在两种调控序列,一种是与基因复制起始相关的序列,主要包括两大类:一类是编码蛋白的开放阅读框架ORF,在乳酸杆菌中与质粒复制相关的ORF之间存在同源性。另一类是与调控有关的非编码序列,主要包括复制相关蛋白作用的靶序列、正-负向复制起始点、缺失位点、启动子等复制调控元件;另一种是控制质粒拷贝数和不相容性的DNA序列。为了开发适用于人和动物的食品级乳酸杆菌表达载体,研究者寻求构建非抗生素标记的质粒载体,现在用于乳酸杆菌表达系统的食品级选择性标记主要有三类:糖类利用标记、营养缺陷型标记、编码细菌素抗性,这样构建出的乳酸杆菌表达系统中,载体、受体及诱导物均为食品级,可直接制成口服制剂。所以,食品级的乳酸杆菌工程菌可直接应用于食品工业和医药保健等领域,有着巨大的应用前景和潜在的商业价值。(1)质粒载体的连接糖类作为选择标记,主要是利用某种糖仅为少数乳酸杆菌利用,而其他乳酸杆菌不能利用其为发酵底物,将能发酵这种物质的乳酸杆菌的基因克隆与乳酸杆菌的质粒载体连接,转化不能利用这种物质的乳酸杆菌中进行表达,这样就可通过该物质作为底物来筛选。POSNO等把可发酵木糖的戊糖乳酸杆菌MD353染色体上的xyl基因克隆到大肠埃希菌-乳酸杆菌穿梭载体pLP3537,得到重组pLP3537-xyl质粒,再将其转入不能利用木糖的干酪乳酸杆菌ATCC393中,结果转化子获得了可利用木糖的能力,由此得到利用木糖发酵作为乳酸杆菌食品级选择标记。(2)外源基因稳定表达一类为以细菌管家基因缺陷株为受体菌,在质粒上克隆入同源或异源完整的受体菌缺陷基因作为外源基因稳定表达的选择标记。此外,还有氨基酸缺陷有关的选择标记。(3)cinf基因lafI基因是LactobacillusjohnsoniiVP111088产生的LactacinF的免疫基因,lafI标记片段小、通用性好,可在许多对LactacinF敏感的乳酸杆菌中使用。此外,嗜酸乳酸杆菌的AciocinA和AciocinB的结构基因和免疫基因已分别在干酪乳酸杆菌与植物乳酸杆菌和发酵乳酸杆菌中表达,这都给利用细菌素免疫基因作为食品级标记提供了可能。2.3乳酸杆菌的免疫活性因子乳酸杆菌是公认安全级(GRAS)菌,其自身及其各种代谢产物对机体也有营养和免疫功能,再加上其携带的目的蛋白的专一性作用,集多种功能于一体,这就是目前在微生态学领域中提出的多功能微生态制剂,因此乳酸杆菌食品级载体的研究与开发具有相当大的潜力和意义。乳酸杆菌是一种良好的疫苗载体,用乳酸杆菌作为疫苗载体不仅可使口服的乳酸杆菌刺激产生粘膜及全身免疫反应,提高某些免疫活性因子如IL-2、IFN-α的分泌,而且可将特异性抗原分子携带并分泌到肠道,同时也可穿过肠壁进入粘膜下层,进而引起细胞免疫和体液免疫。在“全球健康重大挑战”计划中,有一项“改进儿童疫苗,在婴儿出生后不久即可服用,发展不需要注射的疫苗接种系统”,这项计划向我们展示了未来疫苗开发的重点可能是口服疫苗,因此乳酸杆菌表达系统的研制成功可能会引起一场免疫学界的革命。目前,用破伤风毒素C片段(TTFC)作模型抗原已获得许多乳酸杆菌用于免疫接种的知识,并且结合人们对免疫系统认识的不断提高及近来克隆和表达技术的发展,将能利用TTFC以外的抗原,开辟了乳酸杆菌作为活疫苗的真实前景。更有意义的是,法国和巴西已于2000年联手开展在乳酸杆菌中表达轮状病毒的抗原基因,然后用重组的乳酸杆菌发酵生产酸奶,来预防儿童轮状病毒性腹泻。用乳酸杆菌表达外源基因还存在着缺陷,如对乳酸杆菌表达调控的机制尚不太清楚,直接口服重组乳酸杆菌并不能在体内表达足量的抗原,长期低剂量的刺激可能导致机体免疫耐受,口服重组乳酸杆菌可能只对局部病变有较好的预防效果等。但随着研究水平的提高,通过对乳酸杆菌进一步改造、表达调控的认识不断深入和对免疫学特别是粘膜免疫机制的研究,我们将会得到更为优良的益生乳酸杆菌基因工程菌。3双歧杆菌穿透载体双歧杆菌作为基因工程受体菌,对其基因表达系统的研究相对较少。SGORBATI等对1461株共24个种的双歧杆菌进行了质粒的检测,发现四个种的双歧杆菌即长双歧杆菌、球双歧杆菌、星状双歧杆菌及印度双歧杆菌含有质粒。国外学者正努力寻找适用双歧杆菌基因工程载体,MISSICH等成功地构建了l个