两种土壤处理剂对生姜茎腐病菌的体外抑菌试验

两种土壤处理剂对生姜茎腐病菌的体外抑菌试验

目前，植物土壤传播病害的主要包括真菌性疾病、细菌疾病和由线虫感染的疾病。生姜茎腐病、姜瘟病和生姜癞皮病(病原为南方根结线虫)是生姜生产上重要的土传病害,近年来在山东省生姜主产区呈逐年蔓延扩大的趋势,严重影响了生姜的产量和品质。土壤处理是防治土传病害的重要途径,化学熏蒸是土壤处理的重要措施之一,也是目前主要的防治方法。由于常用熏蒸剂溴甲烷对臭氧层的消耗极为严重,目前其主要替代品氯化苦、棉隆、1,3-二氯丙烯等在田间均对土传病害表现出了一定的防治效果。其中氯化苦和棉隆在山东省生姜主产区均有应用,但两者对3种病害的控制能力是否存在差异尚未见报道。目前国内关于熏蒸剂毒力测定方法的报道多针对储粮及卫生害虫,用于病菌测定易导致杂菌污染。Fernando等曾利用密封盘(sealedplates)法测定过苯并噻唑、环己醇等挥发性化合物对真菌的抑制活性。考虑到药剂对真菌、细菌和线虫的活性存在较大差异,本研究对Fernando等的方法进行了改进,采用合适的熏蒸容器分别测定了棉隆和氯化苦对茎腐病菌(真菌)、姜瘟病菌(细菌)和南方根结线虫的毒力,旨在为快速有效地筛选和评价土壤熏蒸剂的活性提供参考。1材料和方法1.1水电空气/空气温度分布99.5%的氯化苦(chloropicrin)液剂(辽宁大连绿峰化学股份有限公司)、98%的棉隆(dazomet)微粒剂(MG,江苏省南通施壮化工有限公司)。GA110万分之一电子天平(德国);LDZX-40BI自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);SW-CJ-LD超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司);WD700微波炉(顺德格兰仕电器厂);THZ-82空气浴摇床(江苏太仓公司);UV-2201紫外分光光度计(日本岛津公司);GXZ型智能光照培养箱(宁波江南仪器厂)。1.2培养了姜疫病原菌生姜茎腐病菌PythiummyriotylumDrechsler由山东省莱芜市农业科学院提供,于18℃生化培养箱中PDA斜面上保存;姜瘟病菌Ralstoniasolanacearum由山东农业大学植物病理系提供,室温下于无菌水中保存;南方根结线虫Meloidogyneincognita采自山东农业大学蔬菜标本园,参照刘维志报道的根结线虫分离方法分离培养,每24h收集2龄幼虫,置于4℃冰箱中备用。1.3培养基a培养基马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基;NA培养基(牛肉浸膏3g,酵母浸膏1g,蛋白胨5g,葡萄糖10g,琼胶15g,蒸馏水1000mL)。1.4测试方法1.4.1不同覆盖厚度的玻璃钟罩对菌落生长的影响采用玻璃钟罩作为密闭熏蒸容器,测定药剂对生姜茎腐病菌的毒力。经转接活化后的菌株于PDA培养基上培养,待菌落长至培养皿3/4大小时,于边缘打取直径约8mm的菌丝块。无菌条件下,向培养皿中倒入2mm高、冷却至45℃的PDA培养基,待培养基凝固后将菌丝块菌丝面向下接种于平板中央,将接种后的平板开盖放置在厚度为0.04mm、面积为50cm×50cm的塑料膜上,设4次重复。同时放置1个盛有无菌水的培养皿盖,在预备试验基础上向其中加入相应剂量的处理药剂(玻璃钟罩容积用水标定为21.07L。棉隆的熏蒸质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.5、5.0mg/L,氯化苦分别为0.04、0.08、0.12、0.16、0.24mg/L)。迅速盖上玻璃钟罩,用皮筋将塑料膜沿玻璃钟罩外壁密封严实,将玻璃钟罩放入25℃培养箱内培养3d。以只添加无菌水组为对照,试验重复3次。用十字交叉法测量菌落直径,按式(1)、(2)计算各处理净生长量和菌丝生长抑制率的平均值。净生长量/mm=测量菌落直径-8(1)菌丝生长抑制率/%=对照组净生长量−处理组净生长量对照组净生长量×100(2)菌丝生长抑制率/%=对照组净生长量-处理组净生长量对照组净生长量×100(2)采用DPS软件分别计算出两种药剂的EC50、EC90、95%置信限和相应的b值及标准差(SD)。1.4.2土壤熏蒸剂对致病性细菌的毒性影响1.4.2.培养姜坯病原菌菌落将保存的姜瘟病菌菌株取出,在NA固体培养基上活化,挑取单菌落置于NA液体发酵培养基中,于25℃、190r/min下振荡培养24h,制得菌悬液。菌悬液用灭菌水稀释1×107倍,取0.05mL稀释后的菌悬液均匀涂抹在PDA固体培养基上,于25℃培养箱中培养1d。记录姜瘟病菌的菌落数量,根据式(3)计算每1mL菌悬液中的细菌数(N)。N=平板上菌落数×稀释倍数平板上加菌液的量/mLΝ=平板上菌落数×稀释倍数平板上加菌液的量/mL(3)1.4.2.测定波长的确定用无菌水将菌悬液分别稀释9、13、17、33、49、65倍,通过预试验确定吸光度在0.1～0.9之间的吸收波长。以不加菌悬液组为对照。在选定的波长下测定不同稀释倍数菌悬液的吸光值,试验重复3次。依据平板活菌计数结果,以菌悬液浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线。1.4.2.添加对药剂的筛选和各处理的菌悬液的抑制率及生长量的测定参照Fernando等报道的密封盘法进行,采用密封盘作为熏蒸容器。无菌条件下,在直径15cm的大培养皿盖中放一张滤纸,加入20mL无菌水保湿。取5mL菌悬液加入直径7cm的小培养皿中,再加入NA液体培养基5mL。将小培养皿去盖后放入大培养皿盖中。在预试验基础上,于湿滤纸上添加各处理药剂(密封盘容积用水标定为1.88L。棉隆的质量浓度分别为1063.8、1595.7、2127.7、2659.6和3191.5mg/L,氯化苦分别为0.09、0.18、0.36、0.54和0.72mg/L),以只添加无菌水组为对照。迅速用另一直径15cm的大培养皿盖盖上,并用封口膜封严,于25℃、45r/min摇床上培养1d。将各处理菌悬液用无菌水稀释13倍,在选定波长下测定不同处理组菌悬液的吸光值,由标准曲线方程获得不同处理的菌悬液浓度。根据式(4)、(5)计算各药剂对姜瘟病菌的抑制率。净生长量=菌液浓度−N26-Ν26(4)抑制率/%=对照组净生长量−处理组净生长量对照组净生长量×100(5)抑制率/%=对照组净生长量-处理组净生长量对照组净生长量×100(5)式中N为每1mL菌悬液中的细菌数。采用DPS软件分别计算出两种药剂的EC50、EC90、95%置信限和相应的b值及标准差(SD)。1.4.3药剂处理和安全性评价采用层析缸作为密闭熏蒸容器。将分离活化得到的2龄根结线虫配制成2000条/mL的悬浮液,分别添加50μL于三孔凹玻片的3个凹穴内,设2次重复。将处理后的凹玻片置于密封性良好的层析缸内,同时放置一个盛有无菌水的培养皿盖,在预备试验的基础上,向培养皿盖中加入处理药剂(层析缸容积用水标定为5.15L。棉隆的熏蒸质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L,氯化苦分别为0.89、1.79、2.68、3.58、4.47mg/L),迅速盖上层析盖并用封口膜封严。以只添加无菌水为对照,试验重复2次。将层析缸于室温下培养48h后取出凹玻片,于空气中暴露放置3min,4×10倍显微镜下镜检,记录根结线虫的死亡情况(虫体僵直且完全停止活动者视为死亡)。根据式(6)、(7)计算各药剂处理死亡率和校正死亡率。死亡率/%=死亡线虫数调查总线虫数×100/%=死亡线虫数调查总线虫数×100(6)校正死亡率/%=处理死亡率−对照死亡率1−对照死亡率×100/%=处理死亡率-对照死亡率1-对照死亡率×100(7)采用DPS软件分别计算出两种药剂的EC50、EC90、95%置信限和相应的b值及标准差(SD)。2结果与分析2.1土壤熏蒸剂对生姜茎腐病的毒性结果(见表1)表明,氯化苦和棉隆对生姜茎腐病菌均表现出较高的毒力,且氯化苦的毒力高于棉隆。2.2土壤熏蒸剂对姜醇菌的毒性2.2.1菌悬液浓度c平板活菌计数结果为每1mL菌悬液中的细菌数(N)=3.2×1010个。以吸光度(A)为纵坐标,菌悬液浓度(c)为横坐标进行线性回归,得标准曲线方程A=0.1345c-0.0713(R2=0.9861,c的单位为109个/mL)。结果表明,在0.49×109～3.6×109个/mL浓度范围内,菌悬液浓度与吸光度值至呈良好的线性关系。2.2.2中毒试验的结果由表2可知,氯化苦对姜瘟病菌的活性较高,而棉隆的活性较低。2.3稳定性试验结果48h后空白对照组存活率很高,均达90%以上,表明试验体系稳定可靠。两种药剂对南方根结线虫的毒力存在一定的差异(表3),其中棉隆对南方根结线虫的活性较高,氯化苦的毒力低于棉隆。3培养培养基及药剂熏蒸容器的大小对试验结果影响较大,容器太小将导致药剂计量困难,试验误差增大。本研究经预试,选取了合适的容器进行毒性试验,所改进的生测方法具有良好的重现性,可为快速准确地评价其他土壤熏蒸剂的毒力提供参考。此外,姜瘟病菌数量的测定若采用平板菌落计数法较为费时且误差较大,利用比色法则更为快捷和准确。NA培养基比LB培养基营养丰富,更适宜姜瘟病菌生长,试验中可根据实际情况选择合适的培养基及发酵培养时间。另外,药剂挥发后可能不易透过菌悬液液面起到杀菌效果,因此应尽量增大液面面积并使用低速摇床培养,使病原菌充分接触液面空气。本研究表明,棉隆对姜瘟病菌活性较低,加之其用量大、成本高、处理时间长,故不推荐专门使用棉隆来控制生姜病害。有研究证明,氯化苦在被激活状态下可生成一种诱导细菌有机体突变的代谢物,对土壤杆菌属细菌防治效果较好,此外氯化苦还能有效控制土传病原真菌,如镰刀菌属、疫霉属、腐霉属、丝核菌属等,其防治土壤真菌的效果比溴甲烷高近20倍。本研究中氯化苦各浓度组对姜瘟病菌和生姜茎腐病菌表现出显著的抑制