植物寄生线虫防治研究进展

植物寄生线虫防治研究进展

植物寄生虫是一种广泛分布于世界的植物致病性。它的寄生虫种类繁多，环境适应性强，几乎不会影响各种作物。大多数植物寄生线虫侵染植物的根或其它地下部分,干扰植物水分和营养物质的吸收,造成直接危害;一些线虫还能传播植物病毒,破坏寄主植物对其它病原物如真菌、细菌的抗性。随着现代农业的规模化发展,植物寄生线虫造成的经济损失逐年上升,短短十几年已由770亿美元增至1250亿美元。我国地处温带和亚热带,气候适宜于线虫的活动和繁殖,世界性重要植物线虫病害在我国均有发生,其中以根结线虫和胞囊线虫引起的危害最为严重。目前,大豆胞囊线虫在我国的发生面积常年在135万hm2以上;根结线虫在保护地蔬菜生产中造成的损失严重时可达70%,甚至绝产;山东发生花生根结线虫已有40多年历史,对花生产量影响极大。因此,植物寄生线虫的严重危害已成为制约我国农业可持续发展的突出问题。防治线虫的传统方法包括轮作、杀线虫药剂、生物防治和抗线虫品种培育等,由于作物轮作不适于防治寄主范围较广的根结线虫,杀线虫药剂的大量使用其费用昂贵并且严重污染环境,生物防治见效缓慢,最为经济有效的途径是培育与利用抗线虫新品种。常规的抗病育种目前存在两方面问题:一是利用单一抗性基因使得不受抗性影响的线虫大量繁殖而发展成为新病害,或造成线虫小种变异;另一方面抗原材料来源匮乏也使常规育种远远不能满足生产需要。因此,迫切需要探索新的抗线虫育种途径。近20年来,随着植物与寄生线虫之间相互作用机制研究的逐步深入,抗线虫基因的分子遗传操作技术已趋向成熟,为利用基因工程方法防治线虫提供了许多新的策略。本文通过国内外近10年有关抗线虫分子育种途径的研究及进展,从抗线虫基因、外源蛋白、特异表达启动子及RNAi4个方面概述了植物抗线虫基因工程的研究进展,展望了其在植物抗线虫育种中的应用前景。1抗胞囊线虫基因利用基因工程技术改良作物,加速育种工作进程,提高植物对线虫的抗性,关键是克隆抗线虫基因。目前已从多种植物中克隆或标记了一些抗线虫基因(表1)。1997年Cai等从抗甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii)的野生甜菜(Betaprocumbens)中克隆了第一个植物抗线虫基因HsIpro-1。此基因在植物根部特异表达,编码一个由282个氨基酸组成的酸性蛋白质。还有几个富含亮氨酸区域(leucine-richrepeat,LRR)构成的受体结构域和一个典型的跨膜区域,可能是定位于膜上的糖蛋白受体。这些结构特征与从番茄中分离的抗叶霉病基因Cf-9、Cf-2和Cf-4具有很大的相似性。这一基因已通过种间杂交和定位克隆技术转移到栽培的甜菜中,并在CaMV35S启动子的控制下得到表达,首次证明可用抗性基因培育抗性作物。另一个抗线虫基因是从小麦中分离的抗胞囊线虫基因Cre3,此基因编码一个含有核苷酸结合位点(nucleotide-bindingsite,NBS)和一个富含亮氨酸区域的多肽,是小麦根部特异表达的基因,与拟南芥的Rps2、Rpm1和Rpp5基因,番茄的Prf和Ⅰ2基因,亚麻L6和M基因,烟草的N基因以及水稻的Xa1基因具有共同的结构特征。随后从马铃薯中分离出抗胞囊线虫基因Gpa2,Gpa2属于LZ-NBS-LRR抗病基因家族成员,与抗病基因Rx1高度同源,然而它们具有不同的病原抗性,表明在分子进化过程中这些具有不同抗性的基因有可能来自于同一祖先。目前一类最重要的抗线虫基因是Mi基因,抗3种主要的根结线虫即南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)和花生根结线虫(M.arenaria)。Mi基因是通过种间杂交胚胎挽救法从野生种(Lycoperisiconperuvianum)导入栽培番茄种(Lycoperisiconesculentum)中的。Mi基因定位于番茄6号染色体上,具有NBS/LRR结构,编码含有1257个氨基酸的蛋白。目前在番茄中国际上发现了9个Mi类抗根结线虫基因,原来的Mi抗性位点表示为Mi-1,新发现的抗性基因分别称作为Mi-2～Mi-9。研究发现Mi基因具有广谱抗性——不但抗根结线虫,还抗马铃薯蚜虫(Macrosiphumeuphorbiae)和烟粉虱(Bemisiatabaci),是唯一具有同时抗3种不同生物的基因。Hero基因是另一个从番茄中分离得到的抗线虫基因,对马铃薯胞囊线虫具有广谱抗性,对马铃薯金线虫的抗性达到95%,对马铃薯白胞囊线虫的抗性达到80%以上。在辣椒属植物中第一个发现的抗线虫基因是N基因,为单显性基因,抗南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫。存在于辣椒属植物中最重要的抗线虫基因是Me类基因家族。这些基因的来源、抗性谱范围、抗病机制、对温度的稳定性各有不同,通过双单倍体群体,在PMZ17和PM687共发现了5个抗病显性基因(Me1-5),其中以Me1、Me3抗性谱较广,抗3种主要的根结线虫M.incognita、M.javanica、M.arenaria,而Me2、Me4、Me5分别控制了一种主要的根结线虫的抗性,或是仅仅抵抗一种线虫的某些株系。近年来,国内外学者围绕大豆对胞囊线虫的抗性问题展开了大量研究。对不同生理小种的线虫,调控的基因不同,例如1号生理小种的抗病性由3对独立的隐性基因控制,3号生理小种的抗病性至少需要3对独立的隐性和1对显性基因控制,非等位基因之间存在互作等。到目前为止,已经命名的基因有rhg1、rhg2、rhg3、Rhg4和rhg5。研究发现,对任一小种没有单一位点能够提供完整抗性,每一小种的抗性一般有2～6个位点控制,不同的小种之间在抗性位点上具有一些共性,尽管不同的小种有不同的位点控制,但其中有一些位点对每一小种的抗性都是必需的。目前比较公认的是rhg1与Rhg4位点,已分别被定位到连锁群G与A2上,并且分离到了紧密连锁的分子标记。Zhang等在棉花上接种根结线虫后,发现了一种抗线虫基因MIC-3,它编码14kDa的蛋白。在果树、生菜、鹰嘴豆、烟草中也分别发现了抗根结线虫的基因。抗线虫基因广泛存在于各类植物中,需要进一步挖掘与开发利用。2外源蛋白及激素外源蛋白介导的植物抗线虫基因工程的策略就是利用植物自身防御体系中的抗病相关基因,或抑制线虫生长或对线虫具有毒性的外源蛋白基因转化感病植物,从而获得对线虫的抗性。目前常用的或具有应用前景的外源蛋白主要分为3类,一类是与植物自身防御体系相关蛋白,如诱导植物获得系统性抗性(systemicacquiredresistance,SAR)反应的化学诱导物、几丁质酶或胶原蛋白、外源凝集素等;另一类是对线虫具有毒性的外源蛋白,如细菌毒素、蛋白酶抑制剂等;还有一类为线虫分泌物特异抗体。获得系统性抗性的化学诱导物,如β-氨基丁酸(BABA)对线虫病害的诱抗效果突出。Oka等研究发现β-氨基丁酸可高效诱导番茄对爪哇根结线虫的抗性,随后,Oka等又研究了β-氨基丁酸对小麦线虫的诱导抗病性,结果证实BABA对小麦根结线虫病和胞囊线虫病都有明显诱抗作用。各种化学诱导物,以及SAR信号传导途径的中间产物是诱导SAR反应并最终赋予植物抗性的有效物质,在抗线虫策略中具有很好的应用前景。几丁质酶是植物防御体系中的重要病程相关蛋白,且具有抗真菌的作用。几丁质酶的分解产物在线虫生长和发育中起重要作用,通过几丁质酶的分解来破坏线虫的结构成分是植物抗线虫基因工程的另一目标。据报道,将几丁质酶作为外源蛋白在感病植物中表达,可以增强对线虫的抗性作用。胶原蛋白是构成线虫体表和消化道表面角质膜的一种主要结构蛋白。线虫蜕皮过程中产生胶原酶以降解旧的角质膜。而植物本身不含胶原蛋白。因此,在转基因植物中表达胶原酶基因,将破坏线虫角质膜的完整性,干扰其正常的蜕皮方式,从而达到抗线虫的目的。外源凝集素能专一性地使细胞表面的抗原糖蛋白连接,这些糖结合蛋白可作为靶标与线虫在不同部位相互作用,如肠道、体表或化感器等。茄科植物凝集素可作为寄主植物与病原菌非亲和性识别的植物识别子,增强植物抗病防卫反应功能。编码雪花莲(Galanthusnivali)的凝集素GNA基因已经导入马铃薯中并得到表达。当表达量达根部总蛋白的0.5%时,可使马铃薯白胞囊线虫(Globoderapallida)的雌虫减少80%,相反,更高的GNA表达量却使雌虫数量增加,这表明仅有某一水平的GNA量对线虫产生效应。选用外源凝集素作为抗线虫外源蛋白应避免对哺乳动物、鸟类也具有毒性的外源凝集素。Geoghegan等发现了一种结合甘露糖和其它糖类的外源凝集素,能有效控制线虫,并对哺乳动物和鸟类无毒性。细菌毒素,如苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)毒素,可以引起害虫消化道麻痹而致死。苏云金杆菌在生长代谢过程中,可产生多种对害虫有毒杀作用的毒素,其中β-外毒素和δ-内毒素对线虫具有活性。δ-内毒素是由cry基因编码,对线虫有活性的cry基因有cry5、cry6、cry12、cry13和cry14。Criffitts等报道Bt外毒素对线虫具有致死作用,将该毒素基因导入感病植株可以防御线虫对感病植株的危害。线虫取食是一种重要的生命活动过程,利用蛋白酶抑制剂干扰线虫的取食和消化是目前研究较多的抗线虫策略。常用的蛋白酶抑制剂有丝氨酸蛋白酶抑制剂、豇豆胰蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂等。Atkinson等首次证明,组成型表达豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpeatrypsininhibitor,CpTI)的转基因马铃薯能够减低胞囊线虫的繁殖率或改变根结线虫的性别比例,向有利于产生雄虫的方向发展。另外,体外实验表明水稻中巯基蛋白酶抑制的野生型(OC-1)和突变型(OCI△D86)能够显著抑制取食细菌线虫的生长,随后在番茄毛细根中表达这2个基因显著地抑制了胞囊线虫在植物中的发育,1997年Urwin等获得转OCI△D86的转基因拟南芥和转OCI△D86与CpTI的双价转基因拟南芥,研究证明转基因拟南芥具有明显的抗线虫活性,而且含双价基因的拟南芥抗线虫能力更强。Atkinson等获得的转OCI△D86基因马铃薯、番茄等植株,经田间测试对根结线虫和胞囊线虫均具有较好的抗性。在线虫侵入植物并形成取食结构的过程中,线虫通过口针分泌大量分泌物,因此利用植物抗体或抗体片段来结合并封闭线虫的分泌物可达到抗线虫的目的。许多外源蛋白是结合线虫分泌物的抗体。根结线虫的唾液分泌物在线虫传染过程中具有重要作用,该分泌物对于线虫在植物中的寄生位点与取食细胞的维持是必需的。一些与线虫中编码腺体分泌蛋白相关的基因已被分离。Rosso报道从杂交瘤细胞系获得这些唾液分泌物的单克隆抗体IgM,并构建编码抗原结合单链Fv蛋白(scFv)的人工合成基因,该基因通过PCR扩增反应从编码来自IgM抗体的不同区域产生。该抗体表现出对线虫唾液提取物的特异结合性,并已在原生质体稳定表达。线虫的卵寄生真菌可以产生破坏线虫卵的蛋白酶,如由真菌(VerticilliumchlamydosporiumGoddard)分泌的枯草杆菌蛋白酶,克隆这些蛋白的基因并用于转基因植物的研究,也能达到特异的抗线虫的目的。3降低基氧化酶抑制剂在食物体内的表达栖居型内寄生线虫侵入植物后形成特定的取食位点结构(nematodefeedingsitestructure),取食位点的形成是寄生线虫和寄主植物之间相互作用的结果。线虫改变了寄主植物中取食位点细胞的基因表达方式,使得大部分细胞表达基因关闭,一少部分受线虫诱导的基因得以表达。利用基因工程技术可鉴定出仅在线虫侵染后才在取食细胞中表达的基因启动子,即受线虫诱导表达启动子,在该启动子的下游导入受该启动子控制的细胞致死基因,它的表达将导致寄生线虫所依赖的植物特异细胞即取食细胞的死亡。显然,该策略的实现首先是对取食位点特异启动子的识别。理想的启动子是取食位点特异诱导启动子,它只在寄主细胞附近表达而在健康植物组织中不表达。近10年来,一些根特异启动子已被分离鉴定,如从拟南芥分离的根特异表达β-微管蛋白基因的启功子TUB-1、丝氨酸/苏氨酸激酶基因的启功子ARSK1、核糖体蛋白L16基因的启功子RPL16A。Atkinson及合作者比较了这3个根特异启动子对巯基蛋白酶抑制剂基因(OCI△D86)在马铃薯根部特异表达的抗线虫活性,发现3个启动子均调节巯基蛋白酶抑制剂基因在根部高效表达,转ARSK1-OCI△D86基因植株对胞囊线虫的田间抗性达到(70±4)%,转TUB-1-OCI△D86基因植株对根结线虫的田间抗性达到(67±9)%,均高于转CaMV25S启动子。因此,TUB-1和ARSK1是构建根特异高效表达的基因工程元件,在植物抗线虫基因工程中具有重要的应用价值。4采用基因功能进行植物寄生虫的研究植物抗线虫基因工程发展迅速,但是真正商品化的转基因植株还很少,主要是因为无论抗线虫基因还是蛋白酶抑制基因,其表达产物均为蛋白质,超表达的转基因可能存在潜在的生物安全问题,而特异启动子下游结构基因的表达可能对与取食位点毗邻的细胞的生存构成威胁,因此,探索基于植物寄生线虫生长发育相关基因的功能丧失,利用反义遗传学途径构建抗线虫基因,已成为最具活力的研究领域之一。RNAi(RNAinterference)是由双链RNA引发的转录或转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。长dsRNA被核酸酶降解成21～23bp大小的片段,与具有序列同源性的mRNA结合并使之降解,从而抑制基因的表达。Fire等从注射双链RNA(dsRNA)秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)肠道导致同源靶标基因RNA沉默现象,首次正式证明线虫存在RNAi现象。随后,相继在植物、真菌、锥虫、涡虫、果蝇、水螅、小鼠和哺乳动物细胞中都发现了这一现象。由于RNAi具有高特异性、高穿透性、高效及高稳定性,因此已被用作大规模分析基因功能的试验手段,并为植物病害防治提供了新的思路和方法。近年来,通过dsRNA溶液直接浸泡线虫或线虫喂饲表达dsRNA的工程细菌或注射释放dsRNA鉴定了秀丽隐杆线虫(C.elegans)染色体I的90%和染色体III的96%预测基因,其中86%具有RNAi功能抑制作用。实验证明,RNAi表型至少可持续两代,这一特点为转基因控制植物寄生线虫奠定了基础。Atkinson及合作者在植物寄生线虫RNAi方面开展了开创性研究,Urwin等利用章鱼胺具有刺激口针型植物线虫吞食溶液进入肠道的功能,将J2胞囊线虫(大豆胞囊线虫H.glycines、马铃薯胞囊线虫G.pallida)浸泡在2～5μg/μL靶标基因正义与反义RNA形成的dsRNA、50mmol/L章鱼胺溶液中,证明章鱼胺刺激浸泡使半胱氨酸蛋白酶、hgctl(大豆胞囊线虫一个未知功能基因)、精子主蛋白(MSP)3个基因的dsRNA可释放到J2肠道,并且RNAi诱变胞囊线虫接种寄主植物14d再分离,发现3个靶标基因的表达明显受到抑制,相应的表观遗传性状也发生改变。Bakhetia试验表明,南方根结线虫中90%～95%的个体吸收了编码一过氧化酶的dsRNA,14d后雌虫的数量和大小受到明显抑制,产卵量减少了70%以上。另外,Elena等成功地利用RNAi技术抑制了线虫几丁质酶的生成。随后,Rosso等研究发现,简苯二酚可刺激南方根结线虫对dsRNA的吸收,并且观察到了明显的RNAi现象,而在取食含有章鱼胺的dsRNA中,未观察到RNAi现象。此试验通过对编码食道腺蛋白的Mi-crt和Mi-pg-1进行干扰,发现92%的个体基因沉默。Chen等利用RNAi分析了马铃薯金线虫的β-1,4内切葡聚糖酶的功能,并证明gr-ams-1基因是在寄主中定位的关键基因。还有一种利用RNAi技术敲除感病基因(如线虫取食位形成相关基因)的策略。即缺失感病基因,达到阻止病源侵入的目的。这种防治策略已有成功例子,例如在拟南芥中缺失pmr6基因,可抑制真菌的侵入。栖居型内寄生线虫侵入植物后形成特定的取食结构,从寄主植物中吸取营养物质,以供其生长发育所需。一旦营养物质供应不足将降低线虫的繁殖率或抑制雌虫的形成,甚至导致线虫的死亡。所以分离与线虫取食位点相关的基因,并抑制此类基因的表达,可达到抗线虫的目的。最早的范例是突变rpe基因,证明rpe是巨细胞早期形成的必要基因。随后研究表明,AtFH6基因编码的膜锚定蛋白参与在取食位点形成中肌蛋白细胞骨架的形成。缺失这类寄主基因,可以达到阻止线虫入侵的目的。所以,利用RNAi技术敲除感病基因抑制线虫的侵染,具有广阔的应用前景。目前国际上已经对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的全基因组序列进行了测定,这将为植物抗线虫基因工程研究提供非常有力的支持。2004年“N”上发布了10种植物寄生线虫79699个EST序列。2004年,Gunsalus等建立了秀