河南规模猪场致病性大肠杆菌对抗菌药物、中药、益生菌的敏感性试验

河南规模猪场致病性大肠杆菌对抗菌药物、中药、益生菌的敏感性试验

猪杆病是由猪杆引起的急性传染病，发病率和死亡率较高，给养猪业带来严重的经济损失。据报道,猪致病性大肠杆菌对目前临床上使用的各种抗菌药均有不同程度的耐药性,从三重耐药到多重耐药,其中五重以上耐药菌株占60%以上,有些甚至是临床刚使用的新型抗菌药物,耐药率就已经达到40%以上。经济发达国家对动物源性微生物耐药性的流行及发展非常重视,相继建立了动物源细菌耐药性监控系统,为疾病防控与耐药性风险评估提供科学依据。然而目前,我国对猪致病性大肠杆菌的耐药性报道还主要局限在抗菌药物敏感性试验,筛选敏感药物,指导临床用药,但这难以解决耐药性的根本问题。益生菌与中药以抗菌、抗病毒、副作用小、无残留、无耐药性等特点,已经成为替代抗生素解决耐药性和药残的重要方案。然而中药、益生菌对猪致病性大肠杆菌的抑菌效果研究,目前仅见对市售1～2种大肠杆菌标准菌株有所报道,而对从规模化猪场分离到的大量病原菌整体抑菌情况未见报道。本研究以从河南省23个规模猪场分离到的87株致病性大肠杆菌为试验菌株,采用纸片扩散法或牛津杯法分别进行各菌株对15种抗菌药、14种中药、7株猪源乳酸杆菌与芽孢杆菌的敏感性试验,目的在于掌握河南省规模猪场致病性大肠杆菌耐药现状,构建耐药图谱,一方面指导临床合理用药,另一方面为利用中药与益生菌生物制剂防治猪大肠杆菌病提供依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1猪源芽孢杆菌益生菌菌株87株猪致病性大肠杆菌,3株猪源乳酸杆菌、4株猪源芽孢杆菌益生菌菌株,由郑州牧专微生物实验室提供。药敏试验质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922,购自中国兽医药品监察所。1.1.2中药黄柏、黄连、黄芩、茵陈、穿心莲、苦参、金银花、连翘、板蓝根、大黄、鱼腥草、青蒿、马齿苋、石榴皮等14种中药购自郑州中药批发市场。1.1.3培养基营养琼脂、普通肉汤、LB等培养基均购自北京奥博星生物技术责任有限公司,按说明配制。1.1.4、复方其他、多西环素、卡那霉素、卡那霉素、卡那霉素、卡那霉素、卡那霉素多黏菌素B、头孢噻呋、诺氟沙星、环丙沙星、四环素、复方新诺明、多西环素、庆大霉素、阿米卡星、新霉素、氟苯尼考、氯霉素、氨苄西林、链霉素、卡那霉素共15种,购自北京天坛生物技术有限公司。1.2方法1.2.1生药含量的测定参照文献利用煎煮法进行,最后将药液浓缩至100mL,使药液中生药含量为1g/mL,8磅灭菌15min,4℃冰箱保存备用。1.2.2中药和敏纸的制备按照参考文献方法进行中药药敏纸片的制备。1.2.3抑菌圈直径测定按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的Kirby-Bauer(K-B)法及判定标准进行。每次测定均以质控菌为对照,只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株的结果才有效。按抗菌药物敏感性试验扩散法标准(见表1),以敏感(susceptible,S)、中介(intermediate,I)、耐药(resistant,R)3种形式对抑菌圈大小作出判定。1.2.4抑菌圈直径采用纸片法,按照文献进行。抑菌效果判断标准,参照文献:抑菌圈直径>15mm,为强抑菌作用;10～15mm为抑菌作用;5～10mm为弱抑菌或不完全抑菌作用;凡无抑菌圈的为不抑菌。1.2.5猪病猪的抗菌试验参照文献采用牛津杯法进行测定,抑菌效果判断标准同1.2.4。2结果与分析2.1抗菌药物对猪寄生虫菌的抗菌试验2.1.1抗菌药物的耐药性从表1可以看出,87株猪致病性大肠杆菌对各抗菌药均产生不同程度的耐药性。耐药率在80%以上有7种,分别为诺氟沙星、四环素、环丙沙星、复方新诺明、多西环素、氨苄西林、链霉素,其中耐药性最强的是诺氟沙星、四环素;耐药率达到了95.4%;敏感率较高的是多黏菌素B,头孢噻呋、阿米卡星,敏感率分别为92.0%,86.2%,74.7%。2.1.2耐药情况分析根据各菌株的耐药情况,把87株猪致病大肠杆菌分成了31种耐药图谱类型,见表2。可以看出,猪致病大肠杆菌呈现多重耐药现象,最少的耐药3种、最多的耐药13种;耐药图谱类型复杂,耐6,7,8,9种抗菌药的菌株图谱类型分别有8,5,6,3种;各菌株在图谱类型中分布不均,有10种图谱类型相应的菌株只有1株,而有6种图谱类型相应的菌株在5～6株;其中八重耐药菌株比例最高,达27.59%;其次是七重耐药菌株和九重耐药菌株,比例分别为20.69%,18.39%;四重耐药菌株、十一重耐药菌株、十二重耐药菌株、十三重耐药菌株比例最低,仅有1株,比例为1.15%。2.2青蒿多糖抑菌活性成分从表3中可以看出,各中药水煎剂中抑菌活性成分对各猪致病性大肠杆菌所产生的抑菌作用不同,其中青蒿没有表现出抑菌活性成分作用。含有抑菌活性成分产生强抑菌效果的中药是石榴皮(52.9%)、黄芩(44.8%)、黄连(34.5%);对各菌株抑菌率达到60%以上的是石榴皮、黄芩、黄连、大黄、金银花、黄柏;抑菌率不到20%的中药是鱼腥草、板蓝根、穿心莲。2.3芽孢杆菌株的抑菌活性成分从表4中可以看出,各益生菌代谢产物中含有的抑菌活性成分对87株猪致病性大肠杆菌都表现出较好的抑菌效果,不存在不抑菌作用。除了巨大芽孢杆菌株含有的抑菌活性成分的抑菌率为88.5%外,其余益生菌含有的抑菌活性成分的抑菌率都在90%以上,其中乳酸杆菌-2菌株与枯草芽孢杆菌菌株代谢产物中含有的抑菌活性成分表现的强抑菌效果最好,强抑菌率分别为94.3%,92.0%。7株益生菌株所含抑菌活性成分对各大肠杆菌的抑菌效果为:乳酸杆菌-2>枯草芽孢杆菌>乳酸杆菌-3>地衣芽孢杆菌>凝结芽孢杆菌>乳酸杆菌-1>巨大芽孢杆菌。3中药、益生菌对猪致病性大肠杆菌的体外抑菌试验抗菌药物药敏感性试验结果表明,(1)河南省规模猪场致病性大肠杆菌以八重耐药菌株比例最高,与易本驰等报道的河南信阳地区猪致病性大肠杆菌(以六重耐药、七重耐药菌株为主)相比,多重耐药性呈上升趋势,这主要是因为大肠杆菌对环境压力的适应性较强,易产生耐药性,同时它还可以通过菌毛将其抗药性质粒传递给其他菌株,导致环境中耐药性菌株增多造成的。(2)耐药率最高的抗菌药是诺氟沙星、四环素,这与樊国燕等报道河南地区耐药性相一致,但耐药率有所上升;敏感率较高的抗菌药是多黏菌素B、头孢噻呋、阿米卡星,这与文献报道有所差异,可能是与不同地区的养殖模式、不同规模猪场用药习惯与饲养环境有关。中药体外抑菌试验结果表明:石榴皮、黄芩、黄连中含有的抑菌活性成分产生的抑菌作用较强;大黄、金银花、黄柏中含有的抑菌活性成分抑菌作用次之;鱼腥草、板蓝根、穿心莲的抑菌活性成分抑菌作用较弱;青蒿中不含对猪致病性大肠杆菌的抑菌活性成分。这与文献报道的结果相一致,但与文献报道的结果不同,可能原因是文献中的试验菌株均为1株,而本研究为87株,由于不同中药所含的抑菌活性成分对不同血清型的猪致病性大肠杆菌的抑菌机理、抑菌作用不同,所以在本试验中表现出同一中药对不同菌株的抑菌效果不同。因此,中药对猪致病大肠杆菌的抑菌机理还有待进一步研究。益生菌体外抑菌试验结果表明:7株猪源益生菌菌株代谢产物中所含抑菌活性成分对各致病性大肠杆菌具有较好的抑菌效果,以乳酸杆菌-2与枯草芽孢杆菌强抑菌效果最好。试验结果中出现不同的益生菌株对同一株猪致病性大肠杆菌的抑菌效果不同,这与文献报道相一致。这主要原因可能是不同种类的益生菌其抑菌机理不同,乳酸杆菌对大肠杆菌的抑制主要是培养过程中产生的代谢物所致,芽孢杆菌的菌液及其代谢产物对致病菌将起到协同、持续、长久抑菌作用,同时益生菌不同的培养时期、不同的接种量对不同血清型的猪致病大肠杆菌的抑菌作用也不同。不同生物制剂对猪致病性大肠杆菌的体外抑菌试验结果表明,三者对猪致病性大肠杆菌都有不同程度的抑菌作用,从广谱抑菌角度,益生菌﹥中药﹥抗菌药物。抗菌药物虽然含有的抑菌活性高,但是菌株对其耐药性产生也很快、也很强,大多数菌株对抗菌药物呈多重耐药性并且呈逐年上升趋势;而中药与益生菌对不同血清型、不同来源、无论是否耐抗菌药物等菌株,普遍都有一定的抑制作用,并且不会产生抗药性;中药与益生菌相比,中药所含抑菌活性要低于益生菌,这可能是中药提取液成分复杂,其中含有大量化学成分具有挥发性或热敏感,在煎煮过程中