拮抗菌生物有机肥对番茄根结线虫病的防治作用

拮抗菌生物有机肥对番茄根结线虫病的防治作用

根结线虫是一种对各种作物造成严重危害的寄生虫线虫。每年根结线虫的经济损失可达1000多亿美元。根结线虫以各种作物的形式广泛，它可以污染大多数常见的植物和杂草。传统的管理方法（如农业轮作、抗病育种和化学农药的使用等）在一定程度上减少了线虫的风险，但作物产量仍然很大。因此，有效控制根结线虫的危害已经成为控制土壤传染疾病的研究热点之一。过去对根结线虫的寄生真菌和寄生细菌研究较多.一些能有效防治根结线虫的拮抗菌尚需要进一步研究其应用技术.例如淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)为根结线虫和根腐线虫兼性寄生真菌,能寄生在虫卵内、破坏结构和同化虫卵物质,使虫卵不能正常孵化,但对人体健康有潜在的威胁.穿刺巴氏杆菌(Pasteuriapenetrans)为根结线虫专性寄生细菌,能寄生在虫体内、破坏组织细胞,吸取其营养,使根结线虫死亡,但该菌不能离体培养,繁殖成本高,推广应用受到很大限制.近年来的研究表明,一些促进植物生长的根际细菌和菌根真菌能通过产生杀线虫的次生代谢产物,诱导作物产生系统抗性,从而达到防治线虫病害的效果.线虫的外表皮主要由胶原蛋白质组成,线虫卵壳通常由外层卵黄层(含蛋白质)、中层几丁质层和内层脂质层组成,能够利用胶原蛋白质的根际细菌对线虫外表皮可能有损坏作用,从而对线虫的繁殖和种群数量起到显著的控制作用.然而,从分解线虫外表皮胶原蛋白的角度,筛选功能微生物用于防治线虫的研究尚未见报道.此外,微生物菌剂剂型对功能菌在土壤中的存活和功能发挥也有影响.而将功能菌与有机肥进行混合发酵,制成具有一定功能的生物有机肥,应用于防治土传病害的研究工作仍然十分有限.本文选择能以胶原蛋白为唯一氮源生长,并能大量产生脂肽类表面活性剂的3株根际细菌,在实验室条件下研究了菌悬液对根结线虫二龄幼虫的致死率和对虫卵孵化率的影响,并通过温室盆栽试验,研究了利用3株菌及其等比例混合菌制成的生物有机肥对番茄根结线虫的防治效果.1材料和方法1.1ymixaymixa试验用菌株XZ-173、SL-25和KS-62分别属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)和多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa),分离自健康的番茄植株根际土壤,全部由江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室提供.该3株菌都能够在胶原蛋白培养基(胶原蛋白2g·L-1,KH2SO40.8g·L-1,CaCl20.1g·L-1,MgSO4·7H2O0.3g·L-1,Agar2%)上快速生长,并具较强的产脂肽和产蛋白酶能力,可能对线虫外表皮和细胞膜具有潜在的损坏作用,但该3株菌对根结线虫的生物防治作用之前尚未研究.3株菌株的实验室保存方法为:LB液体培养基(蛋白胨10g·L-1,酵母膏5g·L-1,NaCl10g·L-1,pH7.0),170r·min-1,30℃摇床培养24h后与20%甘油等体积混合,-70℃超低温冰箱保藏.1.2试验表明的食物和土壤供试番茄(Solanumlycopersicum)品种为合作903.供试土壤取自江苏省宜兴市陆平村根结线虫严重发病的田块.1.3根清线虫的制备在根结线虫危害严重的农田土壤上种植番茄富集根结线虫.取发病较重的根,用自来水洗净,将根剪碎,再用1%NaClO表面消毒2~3min,剧烈振荡5min,湿筛法收集虫卵,用来孵化根结线虫.1.4室内抗旱效果测试1.4.1e菌悬液的制备菌株采用LB液体培养基培养,30℃170r·min-1摇床振荡培养24h,即得菌液.菌液在5000×g下离心5min,去培养基,加入一定体积的无菌水制成2×107cfu·ml-1的菌悬液.1.4.2线虫死亡检测挑取50条左右已孵化的二龄幼虫加入到已灭菌的直径为6cm的培养皿中,各加入5ml不同菌株的细胞悬浮液,于25℃培养箱中放置,每隔8h观察线虫存活情况,观察至24h.记录线虫死亡数目(以针尖碰触虫体无反应判定为死亡),计算二龄幼虫死亡率.每个处理重复3次,以全加无菌水为对照.1.4.3成虫孵化率测定在已灭菌的直径6cm的培养皿中各加入5ml不同菌株的菌悬液,再向其中添加50个左右经过表面消毒的虫卵,置于25℃培养箱中培养,每隔1d观察虫卵孵化状况,记录根结线虫孵化数,观察至第7天,计算虫卵孵化率.每处理3个重复,以只加无菌水为对照.1.5温室内的抗逆试验1.5.1ks-32发酵及根结特性测定分别将3种功能菌XZ-173、SL-25和KS-62的菌株悬浮液按20%(V/W)的量加入到腐熟好的有机肥(以猪粪与氨基酸有机肥按质量比1∶1混合制成,有机质495.7g·kg-1,N58.1g·kg-1,P2O510.8g·kg-1,K2O16.6g·kg-1)中,发酵堆肥制成生物有机肥BOF1、BOF2和BOF3.1.5.2盆栽试验每个盆钵装5kg的根结线虫发病土壤,按1%(W/W)的量施入生物有机肥,试验设计如下:以施未加入功能菌的有机肥(猪粪与氨基酸有机肥按质量比1∶1混合)为对照(CK),处理1(T1)单加BOF1,处理2(T2)单加BOF2,处理3(T3)加入等质量比例混合的BOF1和BOF2,处理4(T4)加入等质量比例混合的BOF1、BOF2和BOF3,所有处理施肥总量相等.由于KS-62生长速度最慢,抗生素平板检测表明KS-62在发酵的肥料中数量较低(104~105cfu·g-1),达不到生物有机肥的功能菌数量标准,加之离体培养对二龄幼虫致死率和虫卵孵化率影响相对较小,没有单独考察其防治效果,但由于该菌具有较强的产酶能力,选作为混合菌成分之一.每个处理设12个重复.番茄种子用0.3%H2O2表面消毒后在25℃光照培养箱中催芽露白,播入育苗盘中,待长出3片真叶时移入盆钵中.盆栽种植40d后,小心地将番茄根系与土壤分离,根系用清水冲洗干净,记录各处理植株的地上部株高、鲜质量及地下部鲜质量与根系根结数,参考Barker等和Benjumin等的方法进行植株根结分级:0~5%的根有根结,0级;6%~20%的根有根结,1级;21%~45%的根有根结,2级;46%~70%的根有根结,3级;71%~85%的根有根结,4级;86%~100%的根有根结,5级.按下式计算根结指数:根结指数=Σ(各级植株数×级别)/调查总株数按Hussy等的方法,每个盆钵取500g根际土,离心湿筛法分离根结线虫;将剪碎的病根在1%NaClO溶液中剧烈振荡4min,分离根结线虫虫卵.分离到的根结线虫和虫卵用来测算土壤中根结线虫数和根系线虫虫卵数目.1.6处理数据数据统计分析使用SPSS13.0统计软件完成,采用邓肯氏新复极差法检验各处理间差异显著性,利用MicrosoftExcel作图.2结果与分析2.1菌株的生长和产酶能力由表1可知,菌株XZ-173水解胶原蛋白效果最明显,在24h时水解圈就达到15.4mm,显著高于菌株SL-25(3.0mm)和KS-62(8.2mm).与菌株SL-25和KS-62相比,XZ-173在流动性和生长速度方面均优于二者,是一株具有应用开发潜力的细菌.菌株KS-62生长虽不如XZ-173迅速,产酶能力却很强,水解圈直径与菌落直径的比值(即HC值)达到9.62,可见,菌株产酶能力与生长速度没有正相关性.2.2菌株对j2的致病性由图1可以看出,供试3种菌株的菌悬液对二龄幼虫(J2)都有致死作用.菌株XZ-173、SL-25和KS-62的菌悬液在8h时就可对J2造成34.5%、25.6%和18.2%的死亡率,对照未出现线虫死亡.随着处理时间的增加,各菌株对J2的致死率逐渐升高,其中以XZ-173菌悬液效果最好,在24h时对二龄幼虫的致死率达到75.9%,而SL-25和KS-62分别为66.7%、50.0%,与对照(17.4%)相比,均能显著提高二龄幼虫的死亡率.2.3对根结线虫成虫的孵化由图2可知,用3种菌株悬液处理根结线虫虫卵,7d虫卵孵化率均显著低于对照,表明供试菌株能够抑制虫卵正常孵化.XZ-173、SL-25和KS-62处理的虫卵孵化率分别比对照(53.6%)降低了35.8%、24.7%和16.0%,其中XZ-173的抑制作用最强.菌株XZ-173对根结线虫虫卵孵化也有很好的抑制作用,而其他两菌株对二龄幼虫的致死率和抑制虫卵孵化效果均不如XZ-173.2.4对根结线虫的防治效果由图3可以看出,利用不同菌株制成的单一或混合菌生物有机肥均能有效减少土壤中根结线虫的数量.处理T1(BOF1)、T2(BOF2)、T3(BOF1+BOF2)和T4(BOF1+BOF2+BOF3)的根际土壤中线虫数分别比对照减少了71.9%、66.7%、81.2%和84.0%,其中以3种生物有机肥混合(T4)的效果最好.比较可知,T1对根结线虫的防治效率要好于T2,而混合处理T3和T4对土壤中根结线虫的抑制率明显高于T1与T2,表明混合菌有机肥对根结线虫的防治效果要好于单一菌有机肥.T4比T3提高了2.8%.2.5对番茄生长的影响施用不同生物有机肥一定程度上提高了作物根和地上部生物量以及冠根比,促进了番茄植株苗期的生长(表2).单一菌生物有机肥或混合菌生物有机肥都对番茄植株的生长有一定的促进作用.地上部株高以T3和T4处理最高,平均达到60.3和60.9cm,分别比对照增加了14.0%和15.1%,且显著高于T1和T2处理.T1、T2、T3和T4处理的地上部单株鲜质量比对照分别增加了10.0、7.1、15.1和17.1g,各处理冠根比与对照相比有所增加但无显著差异.除T4处理的地下部根系鲜质量显著高于对照外,其他处理与对照差异不显著.2.6生物有机肥对3种常用处理根结指数的影响施用生物有机肥能够显著减少番茄根结数、虫卵数和根结指数,有效降低根结线虫对番茄根的侵染(表3).与对照相比,生物有机肥处理的根结数降低了82.2%~90.0%,虫卵数减少了49.6%~86.3%,其中T4处理效果最好,其次是T3处理,再次T1和T2处理.T4处理的根结指数比对照降低了91.4%,在根上几乎观察不到根结,与其他处理间差异显著.施用生物有机肥能够显著促进根系生长.与对照相比,T1、T2、T3和T4处理的番茄根显著变粗,平均根直径分别增加了0.10、0.08、0.11和0.13cm;根显著变长,须根变多,总根长分别增长了12.5%、8.3%、10.2%和19.9%;根总表面积显著提高,但各生物有机肥处理之间差异不显著.3生物有机肥的使用室内离体试验结果表明,供试3种菌株的菌悬液对根结线虫二龄幼虫均具有不同程度的杀伤作用,都可抑制根结线虫虫卵的孵化,其中以菌株XZ-173效果最好,其次是SL-25和KS-62.3种菌株都能在胶原蛋白平板上生长,具有较高的胶原蛋白水解酶活性,可能对根结线虫二龄线虫和虫卵有较强的破坏作用,从而使根结线虫的生长和孵化受到抑制.其中,产酶能力最强的菌株KS-62并没有表现出最好的抑制效果,这可能是由于细菌对根结线虫的作用除了产胶原蛋白酶破坏表皮外,还包括产生的拮抗物质和其他酶的作用.温室盆栽结果表明,施用3株拮抗菌发酵的生物有机肥能显著减少土壤中根结线虫数量,降低植株根上根结数和虫卵数,起到了很好的生防效果.施用生物有机肥对番茄根系的生长起到了促进作用,使得根系变粗、须根变多,营养吸收更充分,长势更好,对线虫病害的抵御能力变强.3种功能菌共同作用,综合防治效果有了显著提高,与前人研究结果一致.这可能是由于单个生防菌株对环境因子依赖性强,不同生态环境对生防菌的定殖有不同的影响,使得单个生防菌株的防效降低.因此,运用不同生防机制的生