黄瓜根结线虫病拮抗菌株筛选及作用机理研究

黄瓜根结线虫病拮抗菌株筛选及作用机理研究

近年来，随着农业产业结构的适应，植物种植面积由难到高，复种指数逐渐增加，根结线虫的危害日益严重，发生区域的不断扩大。这是工厂蔬菜可持续发展的主要限制因素之一。根结线虫（meloidol.）在世界广泛分布，并以各种方式分布。茄子、豆类和甘薯等蔬菜受到根结线虫的破坏，导致普遍约10%的损失和75%的损失。根据调查，在中国发现的蔬菜根结线虫主要有四种类型：南部根结线虫、开花根结线虫、北方根结线虫和爪哇根结线虫。南方四种根结线虫发生在北方的温室里，南部的根结线虫主要是南方根结线虫。对根结线虫的防治,目前国内主要采用化学杀线虫剂,如氯化苦、溴甲烷、滴滴混剂、二溴乙烷、二溴丙烷和吸剂呋喃丹、灭线磷、涕灭威和威百亩等.化学药剂虽然杀虫快,效果好,但用量大,成本高,且对人畜剧毒,破坏土壤微生态环境.近年来,随着科技的进步和人们环保意识的加强,生物防治方法引起了人们的高度重视,将逐渐成为综合防治的重要手段之一.资料报道,线虫天敌主要有真菌、细菌、病毒、立克氏体、放线菌、捕食性线虫、涡虫和原生动物等,将真菌和细菌作为生防因子的报道较多,采用放线菌的较少.本研究以河北省发生较严重的黄瓜根结线虫为实验材料,对已获得的包括细菌、真菌和放线菌在内的多株拮抗菌株进行了复筛实验,对优势菌株的作用机理进行了初步研究.1材料和方法1.1材料表面1.1.1病毒供试拮抗菌菌株由本实验室从设施蔬菜根际分离,保存.黄瓜根结线虫从发病黄瓜根部分离.1.1.2给药处方对照药剂为0.2%(质量分数)阿维菌素乳油(河北威远集团化工厂).1.1.3培养基采用PDA培养基、含锰营养琼脂培养基、高氏一号培养基和麸皮固体培养基等.1.2方法1.2.1卵粒及全网筛的制备采用振荡法分离.在黄瓜生长后期,挖取发病重、根结多的黄瓜根,用清水洗去根部泥土,剪成长1cm的根段,放入500mL三角瓶中,倒入200mL0.5%NaClO溶液,用力摇3min.混合溶液过100目筛,用无菌水冲洗筛上碎片5次,溶液再过500目筛,用无菌水冲洗筛上物,液体收集到容器中,获得卵悬浮液.用移液管移取0.5mL卵悬浮液于培养皿中,用光学显微镜记录卵数,以40倍(目镜10×物镜4)下每视野100个为宜.将收集到的卵块或卵粒置于中性滤纸上,置于200目网筛上,网筛置于盛有清水的盆中,水位高度以刚好浸湿滤纸为宜,然后置于28℃恒温箱中孵化,每隔24h,将盆中水过500网筛,将孵化的二龄幼虫收集于三角瓶中,置4℃冰箱中备用.1.2.2线虫死亡吸取3mL线虫液于培养皿中,然后分别加入1mL拮抗菌培养液,对照加无菌水,每处理3次重复.混合液放入28℃恒温箱中培养,24h后,每皿中加2滴0.05%亚甲基蓝水溶液,5~10min镜检线虫死亡率.虫体蓝色为死虫,不着色为活虫.1.2.3砂浆中线虫死亡数的测定取直径16cm、厚3cm的培养皿15个,灭菌.分别称取待测菌株的麸皮固体培养物各1.5g,与高压灭菌的黏土与沙子(体积比为1∶4)混合物混合均匀.将无菌和混有生防菌的砂土混合物分别填充于培养皿中,各占培养皿一半.中央交接处接入线虫液25mL.每处理重复3次.每皿喷等量的无菌水,保持湿润.盖好皿盖,置于28℃恒温箱中.30d后,将不同处理中的砂土分别移到1000mL烧杯中,加水至1000mL刻度线.用玻璃棒充分搅拌,澄清后,上清液重复过500目筛,将线虫收集到培养皿中.取相同体积线虫液于显微镜下计数.用亚甲基蓝染色法计线虫死亡数.1.2.4阿维菌素乳油质量分数质量分数的测定分别取连茬4,8,11a线虫危害较重的黄瓜大棚土壤,装入高14cm,直径16cm的花盆中,共60盆,其中拮抗菌处理、阿维菌素处理和空白对照各20盆.添加物用量:拮抗菌麸皮培养物,5g/盆;0.2%(质量分数)阿维菌素乳油稀释1000倍,于定植后浇灌,200mL/盆.将2片真叶的黄瓜幼苗(津绿3号)移入,每盆1棵.定植后,除阿维菌素处理外,每盆浇清水200mL.3个月后调查病情指数,分级并记录结果.采用的分级标准如下:0级,无根结;1级,有少数根结,占全根系的1%~25%;2级,根系根结数量中等,占全根系的26%~50%;3级,根系根结数量很多,占全根系的51%~75%;4级,根系根结数量很多,占全根系的76%~100%.病情指数(%)=∑(级数×同级株数)/(总株数×4)×100.注:严重度的百分数是指根瘤长度之和占总根系长度的百分比.1.2.5细田土菌剂用量分别在连茬4,8,11a,线虫危害较重的黄瓜大棚内进行.拮抗菌菌剂于定植时穴施,用前将麸皮培养物与适量干燥细田土混匀,菌剂用量为每棵0.3g;对照为0.2%(质量分数)阿维菌素乳油稀释1000倍,定植后灌根,每棵100mL.菌剂处理、对照药剂和空白处理的各小区面积为20m2,随机区组排列,每处理3次重复,小区周围设保护行.分别在黄瓜定植后1,3,5个月调查发病率及病情指数.分级标准同1.2.4.1.2.6抗虫击穿实验参照1.2.2共同培养法,对拮抗菌体培养液、培养液无菌滤出液和斜面培养菌体悬液进行抗虫击倒实验,各重复3次.分别在10,20,30h时取1mL混合液镜检线虫击倒率.2结果与分析2.1阿维菌素的校正死亡率从表1结果可见,24h后,12株拮抗菌对黄瓜根结线虫二龄幼虫均有一定的杀伤作用,其中S506,Cm05,Ms2对线虫的致死效果最好,校正死亡率分别为48.8%,36.9%和33.6%,0.2%(质量分数)阿维菌素的校正死亡率为50.9%.校正死亡率=(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×1002.2对线虫的致死效果实验发现,所有测试菌株对线虫都有一定的驱避作用(表2),其中Cm05+S506处理的驱避效果最显著,S506次之,再次是Cm05.对线虫的致死效果以菌株S506最佳,死亡率达到了52.0%,其次为Cm05+S506,死亡率为36.3%,Cm05处理的死亡率仅为25.0%.Cm05和S506结合的击倒效果不及单一S506,但驱避效果优于任何单一菌株,是否为2个菌株相互作用的结果,有待进一步研究.2.3对根结线虫的防效将S506直接用于不同连茬年限的土壤中,进行了黄瓜盆栽实验.结果见表3~5.与阿维菌素比较,S506对根结线虫的防效较高,且表现稳定,在不同年限土壤中的防效分别达到了100%,88.7%和87.5%.而阿维菌素处理随连作年限的增加,防效逐渐下降.2.4黄瓜叶片的防效以S506麸皮固体培养物为试材,在连作12a温室大棚小区进行了应用实验,分别于定植后1个月,3个月和5个月进行防效调查,结果见表6~8.黄瓜定植1,3,5个月后,S506对根结线虫的防效分别为75.96%,82.44%和85.29%,防效随时间的延长而增加,而阿维菌素分别为49.20%,27.21%和14.98%,且防效随黄瓜生长期的延后逐渐降低,这可能与阿维菌素在土壤中的降解有关.2.5培养液的击穿效果分别用S506的培养液、培养液无菌过滤液和活菌体与二龄幼虫混合培养,于10,20,30h后检测击倒率.比较实验结果发现(表9),培养液对二龄幼虫的击倒效果最为显著,培养液的无菌过滤液次之,活菌体最差.在3个时间段,菌体培养液的击倒率分别为33.3%,36.5%和42.3%,均达到30%以上;培养液无菌过滤液分别为26.7%,32.1%,32.4%;活菌体仅为6.7%,14.4%和21.6%.结果说明,S506对根结线虫的杀伤作用主要是胞外代谢产物,活菌体的作用较小.3讨论3.1优势菌株的筛选和最佳实验方法的确定目的菌株的筛选有多种方法,但要在短时间内获得具有应用前景的优势菌株,实验方法很重要.本实验采用了室内培养、盆栽生测和田间表达验证相结合的方法,获得了具有较好应用前景的优势菌株S506.3.2病情表现方法对根结线虫危害度的分级有多种方法,常见的有百分比法、根结记数法和根结形态法.根结记数法和植株根系的发达程度有关,不能如实反映病情.根结形态法在根结线虫病发病严重时适用.因此本研究采用常用的百分比法,减少了根量不一致的影响,能更好地反映实际防效.3.3s106对线虫的消毒作用目前对拮抗菌防治线虫机理还不是很清楚,但认为与拮抗菌产生杀线虫物质、改变根分泌物与线虫的作用方式、营养和空间位点竞争以及诱导植物产生抗病性等因素有关.本研究初步确定了S506对线虫的杀伤作用主要是胞外代谢产物,具体代谢物的种类、分子结