黄柏中粗黄酮提取工艺研究

黄柏中粗黄酮提取工艺研究

西兰花也被称为金针菜。有一天，百合会微笑着死去。它通常被称为金针蔬菜，属于百合科玄草科。明代李时珍在《本草纲目》中谓其有安神醒脑、增智宽胸、美颜养血、解热消毒、除烦通乳之功效。其主要化学成分有蛋白质、脂肪、碳水化合物,还有多种维生素、生物碱、苷、黄酮类、胡萝卜素、挥发油、鞣质以及无机矿物钙、磷等。据《中药大辞典》记载,黄花菜含有生物碱0.7%,苷1.8%,黄酮类0.75%,β-胡萝卜素0.36%。黄花菜总黄酮是其重要有效成分之一,它具有增强免疫力、活血化瘀、保肝抗炎、抗菌抗病毒、抑制肿瘤、延缓衰老、抗氧化自由基活性作用等多种保健功能。因此近年来黄酮类化合物成为新药开发研究中的一个非常重要的资源,具有广阔的开发应用前景,本实验采用单因素试验和正交试验对回流法提取黄花菜粗黄酮的最佳条件进行研究,采用单因素试验对超声法提取黄花菜总黄酮的最佳条件进行研究,以芦丁为标准品绘制标准曲线测定总黄酮含量为指标,探寻黄花菜总黄酮制备工艺,为进一步开发可利用资源提供理论依据。1材料表面1.1材料预处理称取过60目筛黄花菜干燥粉末样品5.00g置于索氏提取器中,加120mL乙醚回流4h,脱至无色,自然风干备用。1.2样品的制备精确称取干燥至恒重的芦丁标准品0.1520g,置于250mL容量瓶中,用30%乙醇溶解并定容至250mL,摇匀即得浓度为0.608mg/mL标准品溶液。量取上述溶液0.0mL,1.2mL分别于25mL容量瓶,加30%的乙醇约至12.5mL,加5%的亚硝酸钠溶液0.8mL,放置5min,加5%的硝酸铝溶液0.8mL,摇匀,放置6min,后加4%的氢氧化钠溶液5mL,30%的乙醇定容至刻度,混匀,放置15min。以加芦丁标准品溶液0.0mL的处理液为参比液,对加芦丁标准品1.2mL的处理液在400~800nm范围内扫描,得到其吸收光谱,测得最大吸收波长为510nm。以相同方法将芦丁标准品溶液换为提取液处理后,测得吸收光谱最大吸收波长同样为510nm。据上可知可用芦丁作为黄花菜的黄酮测定用标准品,显色反应后,在最大吸收波长510nm处测吸光度。1.3标准曲线方程准确移取上述芦丁标准品溶液0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40mL于25mL容量瓶中,以上述方法显色反应后,在510nm处测得吸光度。以吸光度(Abs)为纵坐标,质量浓度(C)为横坐标作图。标准曲线方程为A=0.00787C-0.00911,R2=0.9993。根据A与浓度C的关系可绘制出线性很好的标准曲线。说明黄酮的质量浓度在0~58.3680mg/L范围内,A与质量浓度C之间呈良好的线性关系,可按标准曲线法进行定量分析。1.4硝酸盐总总反应物吸光度的测定准确称取1.0mL提取液于50mL容量瓶中,加30%的乙醇约至25mL,加5%的亚硝酸钠溶液0.8mL,放置5min,加5%的硝酸铝溶液0.8mL,摇匀,放置6min,后加4%的氢氧化钠溶液5mL,30%的乙醇定容至刻度,混匀,放置15min,用紫外分光光度计在510nm处测其吸光度。2方法2.1返回提取法2.1.1单因素实验2.1.1.固液比的筛选分别准确称取黄花菜粉末5.00g,置于索氏提取器中,当温度调至95℃时,分别以1︰8、1︰10、1︰12、1︰14、1︰16的固液比加75%乙醇回流提取2h,以确定最佳提取固液比。按标准曲线方法用紫外分光光度计在510nm处测其吸光度。由图2可知,固液比为1︰12时样品含量测定结果所得吸光度很大,且与最大值相差不大,因此,可确定回流提取的最佳固液比为1︰12。2.1.1.提取温度的确定分别准确称取黄花菜粉末5.00g,置于索氏提取器中,温度分别调至80、85、90、95、100℃时,以1︰12的固液比加入75%乙醇回流提取2h,以确定最佳提取温度。按标准曲线方法用紫外分光光度计在510nm处测其吸光度。由图3可知,提取温度T=95℃时,样品含量测定结果所得吸光度有最大值,因此可确定提取温度因素的最佳实验条件为T=95℃,因为其两侧水平所得样品吸光度高于其他,因此确定正交试验的提取温度因素的三个水平为:T=90℃,T=95℃,T=100℃。2.1.1.提取醇浓度的确定分别准确称取黄花菜粉末5.00g,置于索氏提取器中,在95℃下,1︰12的固液比加入75%、80%、85%、90%、95%乙醇回流提取2h,以确定最佳提取醇浓度。由图4可知,当醇浓度=95%时,样品含量测定结果所得吸光度有最大值,因此可确定醇浓度因素的最佳实验条件为95%,因为其两侧水平与其相差不大,因此确定正交试验的醇浓度因素的3个水平为:85%,90%,95%。2.1.1.最佳提取时间的测定分别准确称取黄花菜粉末5.00g,置于索氏提取器中,95℃,1︰12的固液比加入85%乙醇分别回流提取1、1.5、2、2.5、3h,以确定最佳提取时间。按标准曲线方法用紫外分光光度计在510nm处测其吸光度。由图5可知,提取时间t=2.5h时,样品含量测定结果所得吸光度有最大值,因此可确定提取温度因素的最佳实验条件为t=2.5h,因为t=3h所得样品吸光度开始降低,说明时间延长并不能提高黄酮提取效率的率,因此,从省时高效角度确定正交试验的提取温度因素的3个水平为:t=1.5h,t=2h,t=2.5h。2.1.2正交实验2.1.2.1.正交试验设计表12.1.2.提取、溶解方法准确称取黄花菜粉末5.00g,将其包成药包置于索氏提取器中,按上述正交表逐一进行提取,浓缩,溶解,含量测定。见表2~3。比较各因素的极差可知因素A对试验结果影响最大,其次是B→C,所以各因素对黄酮提取效率影响大小顺序为A→B→C,通过正交试验得出的最佳提取工艺为A3B3C2,即醇浓度为95%,在95℃下提取2.5h。2.2超声提取法2.2.1固液比的确定分别准确称取黄花菜粉末5.00g,分别以1︰8、1︰10、1︰12、1︰14、1︰16的固液比向锥形瓶中加入75%乙醇,后将锥形瓶放入超声清洗器中,用铁架台固定住并超声提取40min,以确定最佳提取固液比。按标准曲线方法用紫外分光光度计在510nm处测其吸光度。2.2.2超声提取时间的确定分别准确称取黄花菜粉末5.00g,分别以1︰12的固液比向锥形瓶中加入75%乙醇,后将锥形瓶放入超声清洗器中,用铁架台固定住并分别超声提取20、30、40、50、60min,以确定最佳提取提时间。按标准曲线方法用紫外分光光度计在510nm处测其吸光度。2.2.3最佳提取醇浓度的确定分别准确称取黄花菜粉末5.00g,将药材放入锥形瓶中,当超声清洗器的水温调至55℃时,以1︰12的固液比向锥形瓶中分别加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇,后将锥形瓶放入超声清洗器中,用铁架台固定住并分别超声提取40min,以确定最佳提取醇浓度。按标准曲线方法用紫外分光光度计在510nm处测其吸光度。由上述图表分析可知,固液比为1︰16时样品含量测定结果所得吸光度有最大值,但与1︰12时相差不大,从成本考虑,应选用1︰12的固液比为宜。当t=40min时样品含量测定的吸光度有最大值,当时间过长或过短都能使提取效率降低。当醇浓度为90%时吸光度最大,但当醇浓度为80%时吸光度与90%时吸光度相接近,为了节约成本,在应用于工业生产时,应选用80%浓度的乙醇。3工艺优化3.1水浴锅提取液的制备分别准确称取黄花菜粉末5.00g,将其包成药包置于索氏提取器中,当水浴锅的温度调至95℃时,以1︰12的固液比向150mL的平底烧瓶中加入95%乙醇回流提取2.5h,平行3次。按标准曲线方法用紫外分光光度计在510nm处测其吸光度。3.2超声提取法分别准确称取黄花菜粉末5.00g,将药材放入锥形瓶中,当超声清洗器的水温调至55℃时,以1︰12的固液比向锥形瓶中分别加入90%乙醇,后将锥形瓶放入超声清洗器中,用铁架台固定住并分别超声提取40min,平行3次。按标准曲线方法用紫外分光光度计在510nm处测其吸光度。3.3最佳提取工艺的确定提取效率与吸光度成正比,所以回流法提取效率高于超声法的提取效率。所以黄花菜中粗黄酮提取的最佳工艺优化为:以醇为溶剂且浓度为95%,在95℃下回流提取2.5h。由于不同地区的黄花菜生活环境不同,其所蕴藏的黄酮含量有所差别,