《基于斑马鱼模型的药物早期心脏毒性快速评价方法》征求意见稿

3T/SDYYXHXX—2023基于斑马鱼模型的药物早期心脏毒性快速评价方法本文件规定了基于斑马鱼模型的药物早期心脏毒性评价的方法原理、受试物、仪器设备、试验准备、试验步骤、保证试验有效性的条件、判定步骤、数据处理与试验报告等内容。本文件适用于基于斑马鱼模型的药物早期心脏毒性的评价。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1斑马鱼zebrafish模式动物的一种，常用于教学和科研。生物分类学上属于脊椎动物门、硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、斑马鱼属、斑马鱼种。3.2Tg（cmcl2:EGFP）品系转基因斑马鱼Tg（cmcl2:EGFP）straintransgeniczebrafish实验室常用斑马鱼品系，心脏被绿色荧光标记。3.3性腺发育尚未成熟的斑马鱼。3.4受精后小时数hourspost-fertilization（hpf）斑马鱼胚胎体外受精后的小时数。3.510%致死浓度10%lethalconcentration（LC10）受试物导致10%受试鱼死亡的浓度。没有心跳判定为死亡。3.6心率heartrate心脏每分钟搏动的次数。3.7SV-BA距离SV-BAdistanceSV-BA距离是指静脉窦（SV）和动脉球（BA）之间的距离。3.8心室短轴缩短率ventricularfractionalshortening（FS）心室短轴缩短率（FS心室舒张末期内径（Dd心室收缩末期内径（Ds/Dd。3.9射血分数ejectionfraction每搏输出量占心室舒张末期容积的百分比，称为射血分数。3.10每搏输出量strokevolume舒张末期容积与收缩末期容积之差，即为每搏输出量。4T/SDYYXHXX—20234方法原理斑马鱼的心血管系统在解剖结构和生理功能方面与哺乳动物相似，心脏由心房和心室构成，房室之间存在瓣膜，且其心脏的发育及基因调控机制等也与人类相似。受精后48h，静脉窦、心房、心室发育完成，心脏通过舒缩实现泵血功能。斑马鱼胚胎通体透明，心脏形态和心跳可在显微镜下直接观察，可快速、无创获取斑马鱼心率、心包面积、SV-BA距离、射血分数、短轴缩短率、每搏输出量等心功能评价相关指标。因此，以斑马鱼为试验动物，应用荧光显微成像等技术，以心率、心包面积、SV-BA距离、射血分数、短轴缩短率、每搏输出量等为检测指标，可对药物的早期心脏毒性进行快速定量分析。5受试物5.1受试物配制5.1.1水溶性药物：斑马鱼培养水直接溶解配制成检测溶液。5.1.2非水溶性药物：选用有机溶剂、乳化剂或分散剂等进行助溶，制备成均匀分散的悬浊液或乳浊5.2受试物准备量5.2.1固态受试物检测用量10mg～50mg。5.2.2液态受试物检测用量30mL～50mL。5.2.3半固态受试物检测用量20mg～100mg。5.2.4半液态受试物检测用量20mL～100mL。5.3受试物相关信息5.3.1受试物的名称、性状、批号、规格、生产日期、保存条件、保质期。5.3.2受试物为单体成分时，还需要提供该成分相应的化学信息，包括分子量、分子式、分子结构。5.3.3提供受试物理化性质，包含如下信息：a)在水中或其它溶剂中的溶解性；b)在水中和光中的稳定性；c)温度对受试物稳定性的影响。6仪器设备6.1分析天平。精度0.0001g。6.2体视荧光显微镜。6.3图像采集系统。6.4恒温光照培养箱。精度±1℃。6.5斑马鱼养殖系统。配备温控装置，水循环和过滤装置。6.6水质监测设备。pH计、溶解氧测定仪、盐度计。6.7试验容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受试物可能吸附于聚苯乙烯容器时，应选用惰性材料（如玻璃）来减少吸附。7试验准备7.1受试斑马鱼发育至48hpf绿色荧光蛋白EGFP标记心脏的转基因斑马鱼Tg（cmcl2：EGFP）胚胎，使用脱膜剂（配置方法见附录A）去除包被斑马鱼的外部卵膜。7.2斑马鱼培养水7.2.1斑马鱼培养水使用存放24h以上并经曝气处理的去离子水配制，内含5mmol/LNaCl、0.17mmol/LKCl、0.4mmol/LCaCl2和0.16mmol/LMgSO4。5T/SDYYXHXX—20237.2.2斑马鱼培养水配制方法：用分析天平称取14.658gNaCl、0.633gKCl、2.425gCaCl2和4.06gMgSO4·7H2O，加入1000mL纯净水配制成50×斑马鱼培养水。量取20mL的50×斑马鱼培养水，加入980mL纯净水，配制成1×斑马鱼培养水。注：此培养水为斑马鱼提供最适生存水环境。7.3试验溶液配制7.3.1加入受试物后，试验溶液pH值在6.5～8.0之间，不需调节试验溶液的pH值。7.3.2如果加入受试物后试验溶液的pH值小于6.5或大于8.0，重新配制，调节受试物贮备液的pH值，使其接近加入受试物前稀释水的pH值。用于调节pH值的物质不应使储备液的浓度明显改变，也不应与受试物发生化学反应或产生沉淀。7.3.3非水溶性受试物，添加有机溶剂、乳化剂或分散剂提高受试物溶解度和试验溶液的均匀度。受试物试验溶液中助溶剂浓度不得超过100mg/L。8试验步骤8.1试验分组试验设置空白对照组、阳性对照组和受试物组，如使用助溶剂，增设1个溶剂对照组。8.2空白对照组设置随机挑取发育至48hpf的心脏荧光标记的健康Tg（cmcl2：EGFP）品系转基因斑马鱼，置于24孔板中，每孔含10尾仔鱼和2mL斑马鱼培养水。8.3溶剂对照组设置随机挑取发育至48hpf的心脏荧光标记的健康Tg（cmcl2：EGFP）品系转基因斑马鱼，置于24孔板中，每孔含10尾仔鱼和2mL助溶剂溶液。助溶剂溶液浓度为受试物组使用助溶剂的最高浓度。8.4阳性对照组设置随机挑取发育至48hpf的心脏荧光标记的健康Tg（cmcl2：EGFP）品系转基因斑马鱼，置于24孔板中，每孔含10尾仔鱼和2mL乌头碱溶液，乌头碱溶液浓度为10μM。8.5受试物组设置随机挑取发育至48hpf的心脏荧光标记的健康Tg（cmcl2：EGFP）品系转基因斑马鱼，置于24孔板中，每孔含10尾仔鱼和2mL受试物溶液（配制方法见7.3），受试物试验溶液浓度需＜LC10（没有心跳特征的斑马鱼界定为死亡），试验时根据需要设置多个受试物浓度组。。8.6暴露条件空白对照组、溶剂对照组和受试物组斑马鱼静置于28.5℃±1℃的恒温光照培养箱，连续暴露24h。注：暴露期间禁止喂食。8.7心率检测暴露结束，体视显微镜下计数斑马鱼15秒心跳次数，并计算心率。8.8心包面积和SV-BA距离检测暴露结束，体视荧光显微镜下拍照，并测量心包面积以及SV-BA距离。8.9射血分数、短轴缩短率和每搏输出量检测暴露结束，倒置荧光显微镜下拍摄斑马鱼心跳视频，并提取心室舒张末期和收缩末期图片，测量心室短轴和长轴长度，计算射血分数、短轴缩短率和每搏输出量。9保证试验有效性的条件6T/SDYYXHXX—20239.1每孔内斑马鱼密度小于5尾/mL。9.2水溶性受试物可配制成澄清溶液，非水溶性受试物可选用有机溶剂进行助溶。9.3斑马鱼图像采集时，各组间拍照参数一致。10判定标准10.1各试验组暴露完成后至少90%仔鱼存活，否则对应试验组结果无效。10.2受试物组与空白对照组相比，斑马鱼心率、射血分数、短轴缩短率或每搏输出量在统计学上显著减小（P＜0.05），或斑马鱼心包面积、SV-BA距离显著增加（P＜0.05），此时试验结果可作为受试物具有心脏毒性的支持证据，但不替代人体功能检测。11数据处理11.1统计参数：斑马鱼心率、心包面积、SV-BA距离、射血分数、短轴缩短率、每搏输出量。11.2统计分析方法：方差分析（ANOVA），辅助以T-test检验，分析各试验组间的差异。12试验报告试验报告包含下列内容：a)受试物——物理属性、物理/化学特性；b)受试斑马鱼——学名、品系、来源、发育阶段、受精卵收集方法及后续处理；c)试验条件：1)光照周期；2)试验设计（试验容器及其平行的数目，每个平行中的仔鱼数量）；3)制备储备液的方法；若使用助溶剂，应给出其成分和浓度；4)