GBT 4789.9-2014 空肠弯曲菌检验

第三章食品中肠道致病菌检验

第一节沙门氏菌检验第二节志贺氏菌检验第三节致泻性大肠埃希氏菌检验第四节小肠结肠炎耶尔森菌检验第五节副溶血性弧菌检验第六节空肠弯曲菌检验第六节空肠弯曲菌检验食品安全国家标准食品微生物学检验—空肠弯曲菌检验Foodmicrobiologicalexamination—CampylobacterjejuniGB/T4789.9--2014代替GB/T4789.9--2008、2003概述1）空肠弯曲菌分类地位螺菌科弯曲菌属其中空肠弯曲杆菌对食品安全的威胁最严重。

Campylobacterisoneofthemostcommoncausesofhumangastroenteritisworldwide.Inmanyindustrializedcountries,theincidenceofCampylobacterdiseaseishigherthanSalmonellaandShigelladiseases.CampylobacterisaGram-negative,motile,spiral-shapedbacteriumthatexistsasacommensalorganisminthegastrointestinaltractsofhumansandavarietyofwildanddomesticanimalsincludingcattle,sheep,pigsandbirds.Campylobacterinfectionshavebeenfrequentlyassociatedwiththeconsumptionofcontaminatedpoultryproducts,rawmilk,drinkingwaterandfreshproduce.Among22well-definedspeciesandsub-speciesofgenusCampylobacter,C.jejuniisthemostcommonlyisolatedbacterialspeciesfrompatientswithdiarrhea;however,otherCampylobacterspp.suchasC.coli,C.lariandC.upsaliensishavealsobeenimplicatedingastrointestinalinfectionsinhumans.NatachaLaprade,MichelCloutier,DavidR.Lapenandetc.Detectionofvirulence,antibioticresistanceandtoxingenesinCampylobacterspeciesusingnewlydevelopedmultiplexPCRassays[J].JournalofMicrobiologicalMethods.doi:10.1016/j.mimet.2016.03.009空肠弯曲菌是革兰染色阴性微需氧杆菌。长1.5～5μm，宽0.2～0.5μm；呈弧形，S形或螺旋形，3～5个呈串或单个排列；菌体两端尖，有极鞭毛，能做快速直线或螺旋体状运动；无荚膜。Campylobacterjejunifromaculture(Gramstain,×1000).t.nz/mafnet/rural-nz/...pyl8.jpg›

2）形态特征微需氧，需在2.5-5%氧、10%二氧化碳，85%氮气的环境中生长，42℃时可分离该菌。最初分离时菌落很小，约0.5～1mm，圆形，白色或奶油色，表面光滑或粗糙，转种后光滑型变成粘液型，有的呈玻璃断面样的折光。营养要求高，含血液和血清的培养基上生长良好。根据生长所需温度的不同，不发酵葡萄糖及在1%甘氨酸、3.5%盐液、1%胆汁的培养基中生长特性可鉴别其种。TheprincipalpathogenicspeciesforhumansareCampylobacterjejuni

awww.zoonosis.ac.uk/images/campyl...oll1.jpg3）培养特征生化反应不活泼；不发酵糖类、不分解尿素，靛基质阴性。氧化酶、触酶阳性；在弯曲菌中唯一马尿酸盐成阳性。4）生化特征空肠弯曲菌抵抗力不强，易被干燥、直射日光及弱消毒剂所杀灭，56℃5分钟可被杀死。对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感。近年发现了不少耐药菌株。传染源:患病、带菌的动物和人,是多种动物如牛、羊、狗及禽类的正常寄居菌。

5）抵抗力传播途径

粪一口是主要的传播途径。市售家禽家畜的肉、奶、蛋类多被弯曲菌污染，如进食未加工或加工不适当，吃凉拌菜等，均可引起传染。水源传播也很重要，有报告弯曲菌引起的腹泻患者有60%在发病前一周有喝生水史，而对照组只有25%。所致疾病：空肠弯曲菌有内毒素能侵袭小肠和大肠粘膜引起急性肠炎－腹痛，腹泻，有时发热，偶有呕吐和脱水。可暴发流行或集体食物中毒。被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。潜伏期一般为3～5天，除了引起急性肠炎，还可通过肠粘膜入血流引起败血症和其他脏器感染，如脑膜炎、关节炎、肾盂肾炎等。孕妇感染本菌可导致流产，早产，而且可使新生儿受染。流行特征：本病全年均有发病，以夏季为多。平时可以散发，也可由于食物、牛奶及水被污染造成暴发流行。Campylobacterjejuni:molecularbiologyandpathogenesis/nrmicro/journal/v...8-f1.jpg弯曲菌感染的重要传染源－水发展中国家感染的主要原因未加保护的农村水源危险最大间溪水屋檐雨水城市用水如消毒不慎可引起大爆发常规饮水消毒可预防感染来源网站

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查找相似图片弯曲菌感染的重要传染源－家禽是发达国家弯曲菌感染的主要传染源及危险因素未煮熟的或生的鸡肉；餐馆或野外烧烤的禽肉；接触生肉。USAFoodNet:44%市场销售生鸡肉检出弯曲菌，10%市场销售生鸡肉检出氟诺喹酮耐药的弯曲菌。24％和4％弯曲菌感染者为在餐厅吃鸡肉和火鸡肉引起。鸡、狗、猫及其它农场饲养的动物；动物偶尔腹泻，多数时候表现健康；也是发展中国家的危险因素；两项调查提示屠宰场工人为高危人群。

动物接触与弯曲菌感染/wikipedia/...cter.jpgshapeofC.jejunicellsandrelatedstructures前言

本标准第一法与ISO10272-1:2006的主要区别如下：删除了规范性引用文件、术语和定义、检验原理；增加并完善了各类样品的处理、增菌培养；增加了Skirrow琼脂与0.1%蛋白胨水。

本标准代替GB/T4789.9-2008《食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验》。

本标准与GB/T4789.9-2008相比主要修改如下：修改了标准的中文名称；修改了范围；修改了培养基和试剂；修改了样品处理；删除了药物敏感性试验；删除了第二法全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法。

一、范围本标准规定了食品中空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）的检验方法。本标准适用于食品中空肠弯曲菌的检验。

二、设备和材料

除常规灭菌与培养设备外，其他设备与材料如下：冰箱：2℃～8℃

恒温培养箱：25℃±1℃，36℃±1℃，42℃±1℃

恒温振荡培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃

水浴装置：36℃±1℃，100℃

微需氧培养装置：提供微需氧条件（5％氧气、10％二氧化碳和85％氮气）均质器电子天平：感量0.1g过滤装置及滤膜（0.22μm,0.45μm）显微镜：10×～100×，有相差功能。离心机：离心力≥20000×g生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡

三、培养基和试剂Bolton肉汤：见附录A.1改良CCD(mCCD)琼脂：见附录A.2哥伦比亚琼脂：见附录A.3布氏肉汤：见附录A.4氧化酶试剂：见附录A.5马尿酸钠水解试剂：见附录A.6MuellerHinton琼脂：见附录A.7吲哚乙酸醋纸片：见附录A.8Skirrow琼脂：见附录A.90.1％蛋白胨水：见附录A.10CFA显色平板。1mol/L碳酸氢钠（NaHCO3）溶液。

3％过氧化氢溶液。APTCampy生化鉴定试剂盒。生化鉴定卡。四、检验程序及操作步骤1.样品处理2.预增菌和增菌3.分离4.鉴定

5.结果报告24h～48h样品处理Bolton肉汤预增菌，微需氧

镜检动力试验氧化酶试验过氧化氢酶试验马尿酸钠水解试验报告挑取可疑菌落，接种哥伦比亚琼脂平板36℃±1℃4h42℃±1℃42℃±1℃24h～48h42℃±1℃24h～48h微需氧25℃±1℃生长试验有氧42℃±1℃生长试验吲哚乙酸脂水解试验空肠弯曲菌呈螺旋状运动

＋不生长不生长（＋）（＋）

检验程序Bolton肉汤增菌，微需氧

接种Skirrow与mCCDA琼脂平板，或显色培养基弯曲菌属（＋）1.样品处理2.预增菌和增菌3.平板分离4.鉴定弯曲菌属4.鉴定空肠弯曲菌5.结果报告1)样品处理一般样品

取25g（或25mL）样品（水果、蔬菜、水产品为50g）加入盛有100mLBolton肉汤的有滤网的均质袋中（无滤网的均质袋可使用无菌纱布过滤），用拍击式均质器均质1min～2min；或加入盛有100mLBolton肉汤的均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，经滤网或无菌纱布过滤。将滤液进行培养。鲜乳、冰淇淋、奶酪等

取50g样品加入盛有50mL0.1％蛋白胨水的有滤网均质袋中，必要时调整pH值至7.2±0.2，用拍击式均质器均质155～305，将滤液以20000×g离心30min后弃去上清，用10mLBolton肉汤悬浮沉淀（尽量避免带入油层），再转移至90mL不含抗生素的Bolton肉汤进行培养。贝类

取至少12个带壳样品，除去外壳后将所有内容物放到均质袋中，用拍击式均质器均质1min～2min，取25g样品于225mLBolton肉汤中（l:10稀释），再转移25mL～225mLBolton肉汤中（1:100稀释），将1:10和1:100稀释的Bolton肉汤同时进行培养。蛋黄液或蛋浆

取25g（或25mL）样品于125mLBolton肉汤中并搅匀(1:6稀释)，再转移25mL～100mLBolton肉汤中并搅匀(l:30稀释)，同时将l:6和1:30稀释的Bolton肉汤进行培养。整禽等样品

用200mL0.1％的蛋白胨水充分冲洗样品的内外部，并振荡2min～3min，经无菌纱布过滤至250mL离心管中，16000×g离心15min后弃去上清，用10mL0.1％蛋白胨水悬浮沉淀，吸取3mL～100mLBolton肉汤中进行培养。

需表面涂拭检测的样品

无菌棉签涂布样品表面（面积为50cm2～100cm2)，将棉签头剪落到100mLBolton肉汤中进行培养。水样

将4L的水（对于氯处理的水，在过滤前每升水中加入5mL1mol/L硫代硫酸钠溶液脱氯）经0.45μm滤膜过滤，将滤膜浸没在100mLBolton肉汤中进行培养。

预增菌、增菌在微需氧条件下，以100r/min的振荡速度，36℃±1℃培养4h。必要时测定增菌液的pH值并调整至7.2±0.2。42℃±1℃继续培养24h～48h。分离将24h增菌液、48h增菌液以及相应的1:50稀释液分别划线接种于Skirrow与mCCD琼脂平板上，微需氧条件下42℃±1℃培养24h～48h。另外可选择使用空肠弯曲菌显色平板作为补充。观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态。2)预增菌、增菌和分离微需氧条件的建立－分离培养微需氧条件的建立－

抽气换气法三气培养箱mCCD琼脂平板上的可疑菌落通常有光泽、潮湿、扁平，呈扩散生长的倾向，直径约为1mm～2mm。Skirrow琼脂平板上的可疑菌落为灰色、扁平、湿润有光泽，呈沿接种线向外扩散的倾向；有些可疑菌落常呈分散凸起的单个菌落，直径约为lmm～2mm，边缘整齐、发亮。www.microbiologyatlas.kvl.dk/bio...juni.jpgwww.microbiologyatlas.kvl.dk/bio...gen1.jpg

鉴定弯曲菌属的鉴定

挑取5个或更多的可疑菌落接种到哥伦比亚血琼脂平板上，微需氧条件下42℃±1℃培养24h～48h，按照表1进行鉴定，结果符合表1的可疑菌落确定为弯曲菌属。项目弯曲菌属特性形态观察革兰氏阴性，菌体弯曲如小逗点状，两菌体的末端相接时呈S形、螺旋状或海鸥展翅状a动力观察呈螺旋状运动b氧化酶实验阳性微需氧条件下25℃±1℃生长试验不生长有氧条件下42℃±1℃生长试验不生长a有些菌株的形态不典型。b有些菌株的运动不明显。表1弯曲菌属的鉴定形态观察挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检。动力观察

挑取可疑菌落用1mL布氏肉汤悬浮，用相差显微镜观察运动状态。Campylobacterjejunifromaculture(Gramstain,×1000).t.nz/mafnet/rural-nz/...pyl8.jpg氧化酶试验用铂/铱接种环或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在10s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性。微需氧条件下25℃±1℃生长试验－挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚琼脂平板上，微需氧条件下25℃±1℃培养44h±4h，观察细菌生长情况。有氧条件下42℃±1℃生长试验（—）挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚琼脂平板上，有氧条件下