锁阳中熊果酸含量测定方法的改进

锁阳中熊果酸含量测定方法的改进

锁阳是锁定科的一种独特植物，是一种没有扶手的完整植物。在中医上把植物锁阳的去花序干燥茎用做传统的中药锁阳,又名“不老药”、“金不换”和“沙漠人参”等。明代《本草纲目》记述:“锁阳性温,补肾,益精血,润燥养精治痿弱”。近年来研究证明,它还有防癌、抗癌,免疫调节,延缓衰老,对防治心血管疾病有明显的效果。熊果酸是一种五环三萜类化合物,具有抗癌、肝损伤保护、抗菌消炎和抗病毒等多方面的应用,应用前景广阔。目前熊果酸的提取方法主要有微波萃取法、热回流提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法等。索氏提取法利用溶剂的回流和虹吸原理,使固体物质连续不断地被纯溶剂提取,缩短了提取时间,萃取效率较高。本实验以锁阳为原料,采用索氏提取法提取熊果酸,在单因素实验的基础上,利用正交实验法优选出提取熊果酸的最佳工艺条件,为进下一步开发锁阳的利用价值提供了参考。1材料和方法1.1材料、试剂和机器1.1.1北京恒元启天化工技术有限公司锁阳:甘肃省张掖平西湖地区产;熊果酸标准品:北京恒元启天化工技术研究院;香草醛、无水乙醇、冰醋酸、高氯酸、活性炭、石油醚(30℃~60℃)等试剂:均为分析纯。纱布:科护医疗器械。1.1.2旋转蒸发仪CARY—50型分光光度计:VARIAN公司;T6新世纪型分光光度计;AR2140型电子分析天平:奥豪斯国际贸易有限公司;LABOROTA4000旋转蒸发仪:Heidolph公司;SHB—II瞻环式真空泵:郑州长城科工贸有限公司。恒温水浴锅HH-S:江苏省金坛市医疗仪器厂;粉碎机:瑞安市百信药机器械厂;电热恒温鼓风干燥箱:上海苏达实验仪器有限公司;Dragon-Med移液枪:大龙兴创实验仪器(北京)有限公司;标准筛:新乡市三圆堂机械有限公司;索氏提取装置一套:北京科学仪器厂。1.2方法1.2.1提取乙醇溶液准确称取5g的锁阳粉末(粉碎机粉碎,过40目筛)用纱布包好,放入索氏提取器中,按照不同的料液比加入体积分数为75%~95%的乙醇溶液,加热到提取温度,回流提取3h后,过滤,滤渣再用相同的方法提取一次。合并滤液,减压浓缩,将浓缩液倒入比色管中,用10mL石油醚浸泡24h。然后把石油醚挥干,用10mL无水乙醇溶解,再加入0.5g活性炭脱色,搅拌过滤,重复操作,直至滤液无色,把滤液转移至比色管中,并用无水乙醇定容至10mL,即得样品溶液。1.2.2对照品溶液的制备准确称取105℃干燥至恒重的熊果酸标准品10.20mg,用无水乙醇溶解后配制成100mL的溶液,即得浓度为0.1020mg/mL的熊果酸对照品溶液,备用。1.2.3香草醛-冰醋酸溶液的制备用移液枪准确吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于25mL比色管中,加热挥去溶剂,再加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4mL、高氯酸1mL。在60℃水浴中加热15min,取出放在冰水中冷却,再加入5mL冰醋酸摇匀,5min~60min内在548nm处测定吸光度。以未加对照品的比色液做空白,在波长548nm处测定吸光度值。1.2.4熊乳酸质量配比吸取除杂后的样品溶液0.5mL,用无水乙醇定容至25mL,摇匀后吸取1mL加入比色管,按照标准曲线绘制方法测定吸光度,计算提取液中熊果酸质量百分比:式中:C为熊果酸浓度,(mg/mL);N为稀释倍数;V为最初定容体积,mL;m为样品的质量,g。1.2.5单因素实验1.2.5.熊乳酸的提取分别用浓度为75%、80%、85%、90%、95%的乙醇,在料液比1∶20、提取温度90℃、提取时间3h,提取2次的条件下进行提取,测定提取液中熊果酸的含量。1.2.5.熊乳酸含量的测定分别按1∶15、1∶18、1∶20、1∶25、1∶30的料液比(g/mL),在乙醇浓度为90%、提取温度为90℃、提取时间3h、提取次数为2次的条件下进行提取,测定提取液中熊果酸的含量。1.2.5.不同液比下熊乳酸提取液的制备在乙醇浓度为90%、提取温度为90℃、料液比为1∶20(g/mL)的条件下,分别用1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h,提取2次,测定提取液中熊果酸的含量。1.2.5.熊乳酸含量的测定乙醇浓度为90%、料液比为1∶20(g/mL)、提取次数为2次、每次3h的条件下,于80、85、90、95、100℃提取,测定提取液中熊果酸的含量。1.2.6熊乳酸最佳提取工艺的确定通过单因素试验对上述不同提取工艺参数进行了初步的筛选,为了分析参数影响主次因素,得到最佳提取工艺,进行正交实验,参照单因素实验结果,以影响熊果酸提取率的乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间为4个影响因素,在其3个水平L9(34)进行正交试验,优化最佳提取工艺。L9(34)因素水平见表1。2结果分析2.1标准曲线的回归方程以吸光度(A)为纵坐标,对照品溶液浓度(C)为横坐标作图,绘制标准曲线。所得标准曲线的回归方程为y=0.581x+0.0044,相关系数R2=0.9998。结果表明,熊果酸在0.0204mg~0.1020mg范围内,熊果酸含量与其吸光度值线性关系良好。2.2单因素实验2.2.1料液比的影响乙醇浓度度提取率的影响结果见图1。从图1可以看出,随着乙醇浓度的增加,熊果酸的含量逐渐增加,但是增加幅度比较缓慢。可能是随着乙醇浓度的增加,熊果酸的溶解度逐渐增大,同时一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出量也增加,这些成分与熊果酸竞争同乙醇-水分子的结合,因此随着乙醇浓度的增加,熊果酸的提取率虽在逐渐增加,但增幅很小,考虑到成本的问题,一般乙醇的浓度在80%~95%之间较好。从图2可以看出,随着料液比的减小熊果酸的提取率先增加后降低。原因可能是在一定范围的料液比中,增大溶剂的用量,容易把一些不易溶出的成分提取出来,同时,过小的料液比会造成溶剂和能源的浪费,造成熊果酸提取率的降低,故选取1∶20(g/mL)左右料液比较为合适。2.2.3提取时间的确定从图3可以看出,随着提取时间的不断延长,提取率基本无变化。可能是因为回流的时间越长,溶剂中熊果酸的浓度和锁阳粉末细胞中的熊果酸的浓度几乎相等,达到扩散的动态平衡,熊果酸的提取率增加速度逐渐变慢,同时从节约能源的角度考虑,采用提取时间2h为最佳。从图4可以看出,随着提取温度的提高,提取率逐渐增加。这是因为温度升高,分子运动速度加快,增加了溶剂扩散到固体表面以及溶质通过扩散离开固体表面的速度,同时也增加了溶剂被固体表面吸附以及熊果酸从固体表面解析的速度,提高了熊果酸在溶剂中的溶解度。但是考虑到仪器和能源的节约利用,选择提取温度为90℃为最佳提取温度。2.3熊乳酸最佳提取工艺的确定从单因素实验可以看出,提取时间对熊果酸提取率影响不大,因此在正交试验中固定提取时间为2h,考虑乙醇浓度、提取温度、料液比对提取率的影响。由表2极差分析可知,影响熊果酸得率的主次顺序为C>A>B,即提取温度的影响最大,乙醇的浓度次之,料液比影响最小。乙醇索氏提取锁阳中熊果酸的最佳提取工艺为:A3B1C2D2,即以乙醇浓度为95%,料液比1∶18,提取温度90℃。按照最佳提取工艺进行提取的熊果酸的提取率为38.21mg/g。3锁阳中熊《以干合成》中熊《物》的提取通过单因素实验和正交实验,确定了索氏提取锁阳中熊果酸的最佳工艺条件为:将5g锁阳粉末,在料液比为1∶18,95%乙醇回流提取2